基于二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的潜在分子靶点.pdf

张霞霞,郎艳飞,徐有青.基于二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的潜在分子靶点J.中南医学科学杂志,2023,51(5):625-629.收稿日期 2022-07-24修回日期 2023-08-15基金项目 国家自然科学基金(81570536)作者简介张霞霞,博士研究生,主治医师,研究方向为酒精性肝病,E-mail 为 zhangxiaxia 。通信作者徐有青,博士,主任医师,博士研究生导师,研究方向为酒精性肝病,E-mail 为 。DOI:10.15972/ki.43-1509/r.2023.05.001特约约稿基于二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的潜在分子靶点张霞霞1,郎艳飞2,徐有青11.首都医科大学附属北京天坛医院消化内科,北京 100070;2.北京大学第三医院消化内科,北京 100191专家简介 徐有青,博士,主任医师,博士研究生导师,留美学者。现任首都医科大学消化病学系副主任、中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组副组长、中国中西医结合学会消化内镜专业委员会超声内镜专家委员会共同主任委员、北京中西医结合学会消化内镜专业委员会副主任委员、北京中西医结合学会消化内镜学分会 EUS 学组组长、北京医学会消化病分会委员、北京医学会肝病学分会常务委员、北京医学会消化内镜分会委员、国际超声内镜学会委员、北京市高层次人才消化专业学科带头人。长期从事酒精性肝病基础研究,先后主持国家自然科学基金项目及北京市自然科学基金等课题项目 10 余项,主编或参编教材 20 余部,国内外学术期刊发表论文 150 余篇,培养博士、硕士研究生30 余名。摘 要 目的 基于二代测序技术筛选葛根素作用于酒精性肝炎(AH)的潜在药物靶点和信号通路,探讨葛根素的作用机制。方法 将 8 周龄健康雄性 C57BL/6 小鼠9 只随机均分为对照组、AH 组(构建 AH 小鼠)、葛根素组(构建 AH 小鼠并葛根素处理)。检测各组小鼠肝功能指标。HE 染色及油红 O 染色评估肝脏组织活动性及脂肪变性。基于二代测序技术对 AH 组及葛根素组进行转录组测序,采用 Trimmomatic 软件获取质控数据和 edgeR 软件识别组间差异表达基因。利用 KOBAS 软件进行 GO 分析和 KEGG 分析。结果 与 AH 组比较,葛根素组转氨酶明显降低,肝组织炎症评分及脂肪变性评分均明显下降。二代测序结果显示,AH 组、葛根素组分别平均获得55 601 831个和 52 934 410 个校正后短测序片段,共筛出790 个 GO 成功注释(生物过程574 个,分子功能141 个,细胞成分64个)。两组间差异表达基因上调 178 个,下调 258 个,主要富集于有机酸代谢、细胞骨架的结构组成、微管。KEGG通路富集分析显示 45 条通路。结论 葛根素治疗酒精性肝炎的作用靶点功能富集在有机酸代谢、细胞骨架的结构组成、微管;可能通过氨基酸代谢通路起到治疗作用。关键词 葛根素;酒精性肝炎;二代测序;分子靶点;差异表达基因中图分类号 R575.1文献标识码 AExploration of the molecular targets of puerarin in the treatment of alcoholic hepatitisbased on second-generation sequencing technologyZHANG Xiaxia1,LANG Yanfei2,XU Youqing11.Department of Gastroenterology,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100070,China;2.Depart-ment of Gastroenterology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,ChinaABSTRACT Aim To screen the potential therapeutic molecular targets and signaling pathways,and to prelimina-rily explore the protective mechanism of puerarin in the treatment of alcoholic hepatitis(AH),based on second-generationsequencing technology.MethodsNine healthy male C57BL/6 mice(8-week old)were randomly divided into thecontrol group,the AH group,and the puerarin group(AH mice treated with puerarin).Liver function of mice in eachgroup were measured.Liver tissue activity and steatosis were measured by using HE staining and oil red O staining.Second-generation sequencing was performed on AH model group and puerarin treatment group.Quality control data wereobtained by Trimmomatic software and differentially expressed genes were identified by edgeR software.KOBAS softwarewas used to analyze the GO function and KEGG signaling pathway enrichment.Results The puerarin group showed a526CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期significant decrease in transaminase,as well as a significant decrease in liver tissue inflammation and steatosis scores,com-pared with the AH group.The second-generation sequencing results show that,an average of 55 601 831 and 52 934 410corrected short sequencing fragments were obtained in AH group and puerarin group,respectively.A total of 790 GOfunctional enrichment genes were screened successfully(574 biological processes,141 molecular functions and 64 cellularcomponents).There were 178 up-regulated genes and 258 down-regulated genes differentially expressed between the twogroups,which were enriched in organic acid metabolism,cytoskeletal structure and microtubule.KEGG pathway enrich-ment analysis showed 45 pathways.ConclusionThe molecular targets of puerarin in the treatment of AH are func-tionally enriched in organic acid metabolism,cytoskeletal structure and microtubule.Puerarin may play a role in protec-ting AH by the modulation of amino acid metabolism pathway.KEY WORDSpuerarin;alcoholic hepatitis;second-generation sequencing;molecular target;differentiallyexpressed genes 酒精性肝炎(alcoholic hepatitis,AH)导致约10%20%患者肝硬化,而酒精性肝硬化是肝脏相关病例死亡的主要原因1。目前临床上 AH 的有效治疗手段欠缺,因此,积极寻找其有效治疗 AH 的临床药物甚为急迫2-3。葛根素是从葛根中分离的天然异黄酮类衍生物活性物质,具有抗肿瘤和抗病毒的作用,可解诸毒,尤善解酒醒脾4-6。本课题组前期研究已论证葛根素对酒精性肝炎具有较好的治疗作用,但具体作用机制及作用靶点尚未明确7-8。本研究基于分子二代测序技术探究葛根素治疗 AH的潜在分子靶点及作用机制。1 材料和方法1.1 材料与仪器C57BL/6 雄性小鼠(维通利华公司);葛根素(山西西安瑞林生物科技有限公司);TRIzol 试剂盒(Invitrogen 公司,美国);反转录试剂盒(Takara 公司,日本);分光光度计及 Qubit3.0 荧光定量仪(赛默飞世尔科学公司);全自动生化分析仪(Hitachi-7180);Illumina 平台(型号 DR08502,武汉)。1.2 实验动物及处理8 周龄健康雄性 C57BL/6 小鼠 9 只,饲养于(232)、湿度40%70%,12 h 黑夜/白昼标准环境中,自由进食饮水。适应性喂养 1 周后,随机均分为对照组、AH 组、葛根素组。AH 组及葛根素组予含 5%Lieber-DeCarli 酒精液体饲料饲养,第 6 周予乙醇灌胃 1 次(5 g/kg),葛根素组在酒精饲养同时,尾静脉注射葛根素(4.2 mg/kg,1 次/日),对照组予同等热量液体饲料饲养。第 8 周末各组小鼠进行安乐死,留取血清及组织标本。1.3 肝功能指标测定待血液凝固后,离心 5 10 min,3 000 r/min,取上层血清置于全自动生化分析仪设定位置上,进入“校准登记”后,测定谷丙转氨酶(glutamic-pyruvictransaminase,GPT)和谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetictransaminase,GOT)。1.4 RNA 提取与质检研磨的肝组织标本加入1 mL TRIzol 涡旋混匀;置于冰上数分钟至溶液澄清,加 200 L 氯仿,摇晃15 s,冰上放置 2 3 min;离心后取上层转移至 EP管中,加入 1 倍体积异丙醇,混匀,-20 放置30 min,离心后弃上清,加入 1 mL 75%乙醇洗涤、离心,重复上一步骤,弃上清,小枪头吸净管中液体,室温 干 燥 2 min,加 适 量 DEPC 水 溶 解 RNA,Nanodrop 仪器对 RNA 浓度和纯度进行测定,使用Qesp1000(RQN 值)检测 RNA 的完整性。1.5 肝脏组织 HE 染色将肝脏组织标本浸泡于福尔马林中 4 6 h,OCT 包埋盒固定样本,流水冲洗过夜 10 h。将组织装入包埋盒中,应用 Leica ASP300S 全自动脱水机脱水、透明和浸蜡,切片后进行 HE 染色,中性树胶封片,于光学显微镜下观察,采集图像。其中肝脏组织学活动性采用 Knodell 组织活性指数(histo-logical activity index,HAI)评估9,总分 22 分,分数越高表示坏死越严重。1.6 肝脏组织油红 O 染色取新鲜肝脏组织液氮速冻后,OCT 包埋,6 8 m 切片,蒸馏水充分洗涤,油红染色 10 15 min,HE 染核 1 2 min,水洗,盐酸酒精分化,返蓝,水洗,甘油明胶封片,光学显微镜下观察,采集图像。脂肪变性评分参考文献10,总分 4 分,分值越高表示脂肪变性程度越高。1.7 RNA-Seq 测序及分析取 5 g 总 RNA 建库,利用磁珠回收目的大小片段进行 PCR 扩增,质检合格后上机测序。使用FastQC 进行质量控制,具有90%覆盖度的参考序列比对的读数保留,通过质量过滤器(CLC Genomics626ISSN 2095-1116 Medical Science Journal of Central South China,Vol 51,No 5,2023Workbench v4.9)的序列使用。获得高质量的测序数据,将数据比对到项目物种的参考基因组上,获得全面转录本信息,采用 Trimmomatic 0.36 软件获取质控数据和 edgeR 3.12.1 软件(http:/biocon-ductor.org)识别组间差异表达基因,使用 KOBAS2.2.1 软件(http:/.)进行基因表达定量及 GO、KEGG 分析。1.8 统计学方法采用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料采用 t 检验,GO 及 KEGG 富集条目 P 通过 Fisher精确检验,相关性分析通过 Pearson 法进行计算。P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组小鼠肝组织学形态及血清 GPT、GOT 变化HE 及油红 O 染色结果显示,对照组小鼠肝细胞形态完整、细胞核无增大、肝小叶形态完整;AH组小鼠弥漫性脂滴堆积和局灶性炎症细胞浸润;葛根素组肝组织炎症较 AH 组改善,脂肪变性明显减轻。葛根素组 HAI 评分较 AH 组明显下降(P 0.05)。AH 组较对照组 GPT、GOT 水平明显升高(P0.05),而葛根素组较 AH 组 GPT、GOT 水平则明显下降(P0.05;图 1)。图 1 各组小鼠肝组织学形态及血清学变化a 为 P0.05,与 AH 组比较;b 为 P0.05,与对照组比较;c 为 P0.05,与葛根素组比较。2.2 RNA 提取及质检结果OD260/280、OD260/230 均大于 1.8,完整性检测较好(RQN 值均大于 7.0),琼脂糖凝胶电泳检测RNA 文库插入片段大小在 400 bp 左右(图 2A)。3例 AH 组和 3 例葛根素组分别获得 55 601 831 个和52 934 410 个矫正后短测序片段,主要分布在外显子区,其次是内含子区及基因区间区(图 2B)。2.3 基因表达的层次聚类结果采用 RPKM 值作为基因表达量的衡量指标消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响。基因表达的层次聚类结果如图 3 所示,绿色、红色分别代表通过基因表达水平获得较低的样品间相关性和较高的样品间相关性。由同一节点产生的分支线段代表对应的样品可以聚到一类,分支的长度代表样本的相似度:长度越短,样本间相似度越高;长度越长,样本间相似度越低。图 2 RNA 提取及质控结果A 为琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小;B 为各标本测序片段在参考基因组上不同区域的占比图;C 为 AH 组;T 为葛根素组。726CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期图 3 基因表达的层次聚类结果图(C 为 AH 组,T 为葛根素组)2.4 GO 功能富集分析与 KEGG 通路分析AH 组和葛根素组间有较多差异表达基因,上调 178 个,下调 258 个(图 4)。在差异表达基因中显著富集的 GO 功能条目包括 574 个为生物过程,141 个为分子功能,64 个为细胞组分。涉及的 GO富集量主要集中在脂质分解代谢过程的正向调节、细胞骨架的结构组成、微管等方面(图 5)。研究显示两组间差异表达基因被分为 45 条 KEGG 通路。两组间上调和下调的差异表达基因前 10 条 KEGG通路见图 6。图 4 AH 组及葛根素组间差异表达基因散点图图 5 差异表达基因中显著富集的 GO 功能条目图 6 KEGG 通路结果3 讨 论随着经济发展及生活方式的改变,酒精性肝病的发病率逐年上升;全球每年大约 250 万人死于过量饮酒,是 15 49 岁年龄段壮年男性的主要致残病因,造成巨大社会经济负担11-12。研究表明,除戒酒及肝移植外,糖皮质激素仅被认为对晚期酒精性肝硬化有效,但对长期生存率的改善度尚未可知,同时禁忌证较多限制了其临床应用13。葛根素在较多疾病中的抗炎作用已得到初步证实,如在结肠炎14及肾损伤中发挥保护作用4,在酒精性肝损伤中可促进酒精代谢作用,也可通过调节肝细胞上皮-间充质转化改善肝纤维化8,15-17;826ISSN 2095-1116 Medical Science Journal of Central South China,Vol 51,No 5,2023但其抗酒精性肝损伤的机制研究甚少,治疗作用靶点尚未明确。本研究对葛根素治疗的 AH 小鼠进行基因转录组二代测序,探究其潜在作用靶点,为临床用药提供实验依据18。本研究显示 AH 小鼠造模成功,同时葛根素治疗组较 AH 组转氨酶明显下降,HAI 评分及脂肪变性评分均明显改善,提示葛根素对酒精性肝炎具有一定的保护作用。鉴于目前可获取的临床治疗酒精性肝炎的药物有限,葛根素可作为潜在治疗酒精性肝炎的临床用药。本研究进一步通过二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的可能靶点,测序结果显示,AH 组、葛根素组分别平均获得 55 601831 个和 52 934 410 个矫正后短测序片段,测序片段主要分布在外显子区,其次是内含子区及基因区间区。AH 组和葛根素组间差异表达基因中,下调258 个,上调 178 个。通过 GO 成功注释,574 个差异表达基因为生物过程,141 个为分子功能,64 个为细胞成分。特异性差异表达上调基因进行了详细的 GO 项富集分析,主要涉及到有机酸代谢、细胞骨架的结构组成、双链 RNA 结合、微管、髓鞘、外泌体等。两组间上调和下调的差异表达基因进行了KEGG 富集分析,主要富集在氨基酸代谢途径以及缝隙链接、吞噬体、谷胱甘肽代谢、P53 信号通路等,其中氨基酸代谢(酪氨酸代谢、精氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢)途径可能是葛根素作用治疗的潜在靶点,为后续进一步研究提供了有利证据。综上所述,葛根素对改善酒精性性肝炎具有一定疗效,可能作为潜在的酒精性肝病的临床治疗用药,本研究使用二代测序技术对葛根素治疗酒精性肝炎小鼠的转录组进行全面分析,探究葛根素治疗潜在靶点,为葛根素药物在酒精性肝病治疗方面提供理论基础,为酒精性肝病提供新的临床治疗药物。参考文献1 SINGAL A K,MATHURIN P.Diagnosis and treatment of alcohol-asso-ciated liver disease:a reviewJ.JAMA,2021,326(2):165-176.2 THANDA HAN M A,PYRSOPOULOS N.Emerging therapies foralcoholic hepatitisJ.Clin Liver Dis,2021,25(3):603-624.3 VAN MELKEBEKE L,KORF H,TSOCHATZIS E A,et al.Treat-ment of severe alcoholic hepatitis:a systematic reviewJ.CurrOpin Pharmacol,2021,60:91-101.4 WANG J Y,GE S K,WANG Y Q,et al.Puerarin alleviates UUO-induced inflammation and fibrosis by regulating the NF-B P65/STAT3 and TGF-1/smads signaling pathwaysJ.Drug Des DevelTher,2021,15:3697-3708.5 ZHOU Y X,ZHANG H,PENG C.Puerarin:a review of pharmaco-logical effectsJ.Phytother Res,2014,28(7):961-975.6 沈佳妍,徐婧淇,刘淼,等.天然黄酮类化合物改善酒精性肝病作用及机制的研究进展 J.中南药学,2022,20(2):371-381.7 YANG J F,WU M M,FANG H,et al.Puerarin prevents acuteliver injuryviainhibitinginflammatoryresponsesandZEB2expressionJ.Front Pharmacol,2021,12:727916.8 LIU Y S,YUAN M H,ZHANG C Y,et al.Puerariae lobatae radixflavonoids and puerarin alleviate alcoholic liver injury in zebrafish byregulating alcohol and lipid metabolismJ.Biomed Pharmacother,2021,134:111121.9 KNODELL R G,ISHAK K G,BLACK W C,et al.Formulation andapplication of a numerical scoring system for assessing histological ac-tivity in asymptomatic chronic active hepatitis J.Hepatology,1981,1(5):431-435.10 KLEINER D E,BRUNT E M,NATTA M V,et al.Design andvalidation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liverdiseaseJ.Hepatology,2005,41(6):1313-1321.11 DAZ L A,IDALSOAGA F,FUENTES-LPEZ E,et al.Impactof public health policies on alcohol-associated liver disease in LatinAmerica:an ecological multinational study J.Hepatology,2021,74(5):2478-2490.12 VENTURA-COTS M,BALLESTER-FERR M P,RAVI S,et al.Public health policies and alcohol-related liver diseaseJ.JHEPRep,2019,1(5):403-413.13 OSNA N A,DONOHUE T M,KHARBANDA K K,et al.Alco-holic liver disease:pathogenesis and current managementJ.Al-cohol Res,2017,38(2):147-161.14 JEON Y D,LEE J H,LEE Y M,et al.Puerarin inhibits inflam-mation and oxidative stress in dextran sulfate sodium-induced colitismice modelJ.Biomed Pharmacother,2020,124:109847.15 ZHAO L,WANG Y,LIU J,et al.Protective effects of genisteinand puerarin against chronic alcohol-induced liver injury in micevia antioxidant,anti-inflammatory,and anti-apoptotic mechanismsJ.J Agric Food Chem,2016,64(38):7291-7297.16 WU T,LIU T,XING L J,et al.Baicalin and puerarin reverse epi-thelial-mesenchymal transition via the TGF-1/Smad3 pathway invitroJ.Exp Ther Med,2018,16(3):1968-1974.17 张伟,李万军,杜芬.葛根素对急性肝衰竭小鼠脾脏淋巴细胞亚型和肝脏炎症反应的影响J.临床和实验医学杂志,2022,21(6):561-565.18 张蓉,张晓艳.基于二代测序用于瘦素缺陷 T2DM ob/ob 小鼠与 C57BL/6 小鼠的转录组差异分析J.中南医学科学杂志,2021,49(5):512-517.(此文编辑 蒋湘莲)926CN 43-1509/R 中南医学科学杂志 2023 年第 51 卷第 5 期