生物化学-第4 章 核酸化学.pdf

第四章核酸第一节概述一、核酸的发现：1868年，瑞士生物学家Miescher（米歇 尔）从外科手术绷带上脓细胞的细胞核中分离出来的白色微 酸性有机物一“核素”，即后来的DNA。二、核酸的类别、分布和功能1、类别：根据所含糖单位的不同分为DNA和RNA2、分布：RNA主要分布于细胞质，对于DNA：原核：裸露的核DNA分子、质粒DNA（原核生物细胞内存在于核DNA外，能够独立自主地进行复制并稳定遗传的双链环 状DNA分子。）5 八真核：细胞核DNA：与组蛋白、非组蛋白形成染色体细胞器DNA：双链环形，一般裸露3、功能(1)DNA是主要的遗传物质直接证据：1944,0.Avery(艾佛利)肺炎双球菌转化实验1952,A.D Hershey 和M.Chase(赫尔希，蔡斯)噬菌体感染实验(2)RNA的功能一参与蛋白质的生物合成肺炎球菌转化实验s型：细菌有荚膜，菌落光滑,毒性菌株R型：细菌无荚膜，菌落粗糙,非毒性菌株(c)(d)(b)284第II篇 结构和催化作用无放射性放射性110-13 Hershey-Chase 韩醐同朦麻的脑 他瞩-触甲就DNA的雕翻炉份胎制 舶夕精能薮鞭（DNA是稀釉,而穗釉琳含 趾胭醐就削籁体酷赫珊罪滞融的雅I 酷麟轴聊崎以独髀钟献髓魅幽部 髀就福的夕橱地筑汾刑用邛航的辘概 蒯批,在独翘了吼箍筑脑翻也表飕管体 DNA趴了螂。胎鼠的髓例就捌艮在脚港 魏嬲性，雕筑含有%在麟麟硫-蒯晡消 腋歌加螂产好代牖腌,表脯载辘跳船 盆是螭物DNA而相朋导人也.（2）RNA的功能一参与蛋白质的生物合成（核糖体蛋白（r蛋白）rRNAI（转肽酶活性）第二节核酸的化学组成核酸的元素组成：C、H、O、N、P等特点（与蛋白质比）：不含S,但P元素含量较多 且恒定。核酸的单体组成成分：核酸（多聚核昔酸）水解-厂磷酸n核昔龈戊糖Y、碱基核 昔J(2)喀咤(Pyrimidine)uracil U cytosin e C th ymin e T核酸中也存在一些不常见的稀有碱基05甲基胞喀咤(m5C)5 羟甲基胞喀咤(Om5C)次黄噂吟(I)核酸中的戊糖：BD吠喃戊糖7J工三、乐潮昔键:在喋吟核昔中均为CJ-N9,喀咤核甘酸中的糖昔键为核昔是核糖或脱氧核糖与喋吟或喀咤碱基生成的糖昔。脱氧核昔-5,-磷酸核甘酸的其他表示方法:5-核昔酸pA,pT,pG,pC,pUo3-核甘酸Ap,Tp,Gp,Cp,Upo游离的2-核甘酸较少，用Gp2,表示相应的牙-核昔酸。环化核昔酸:3,5-cAMP3,5-cGMPJ罗节核酸的分子结构那一脱氧核糖核酸的一级结构 由数量极其庞大的四种脱氧核糖核甘酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通过,3,5-磷酸二酯键连接起来的直线形 或环状多聚体。直线形多聚核甘酸链具有方向性：5，一a3通常5-端为磷酸基团，3端为-0H。pApCpTpG O/7 JJ二、DNA的空间结构J DNA的二级结构 DNA的三级结构 DNA与蛋白质复合物结构3、，39()DNA的二级结构1953年由 Watson 和Crick 提出DNA双螺 旋结构模型James WatsonFrancis Crick双螺旋结构模型建立和提出的主要依据：(1)查加夫定则(a)通常不同的物种，其DNA碱基组成不同。(b)同一物种的不同组织，其DNA碱基组成相同(c)在特定的物种中，其DNA碱基组成不随机体年龄、营养 状况或所处环境的变化而变化。(d)在所有生物DNA中，A-T,G-C喋吟总数等于喀咤总数：A+G=C+T(2)对DNA纤维的x晶体衍射分析英国威尔金斯(Wil kins)和弗兰克林(Frankl in)发现不同来源 的DNA纤维具有相似的X射线衍射图谱。这说明DNA可能有共同 的分子模型。并从图谱分析DNA呈螺旋状结构。1.WATSON-CRICK结构模型要点(1)构架：两链反向平行链沿同一中心轴缠绕，且均为右旋。(2)成分排布：糖-磷酸主链构成亲水骨架在螺旋外侧，碱基对平面在 内侧，它们是疏水性的，且平面与螺旋轴垂直。(3)碱基配对规律：A=T(两个氢键)，G=C(三个氢键)(4)结构参数：在双螺旋的表面形成一个大沟和一个小沟。螺旋每圈含有 10个碱基对，螺距为3.4nm,双螺旋平均直径2nm。根据碱基互补原则，可以由一条链的碱基顺序推知另一条链的碱基顺序。_ I JFigure 1.6 The doubl ehel ix maintains a constantwidth because purines al ways face pyrimidines in the compl ementary A-T and G-C base pairs.The sequence in the figure is T-AC-GA-TG-CHC N-H/N-C 七H。国 O H-N卜气 HN力/N-h c-cHcf HNZNC1 H HCHNq N HN=CHN磷酸与脱氧核糖彼此通过 3,、5,磷酸二酯键相连接,构成DNA分子的骨架。ch3,ccCHrH H c/CN3/CN万NV H-N H3C C-CN-N-H N/N=C:C-N小一H OH磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧，喋吟与喀咤碱位于双螺旋的内侧鲁7Figure 1.7 Fl at base pairs l ie perpendicul ar to the sugar-phosphate backbone.碱基平面与纵轴垂直，糖环平面与纵轴平行两条核甘酸链之间依靠碱基间的氢链结合在一起。两条反平行的多核昔酸链绕同一中心 轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条5，-3，另一条3，f5，每圈螺旋碱基数10bp,碱基堆积距0.34nm,双螺旋平均直径2nm,大沟：宽 1.2nm,深0.85nin,小沟：宽0.6nm,深0.75nm稳定DNA双螺旋的作用力：(1)互补碱基之间的氢键(2)碱基堆积力：相邻碱基平面间冗电子云可以 相互作用(就类似金属中的自由电子)；疏水的碱 基产生的作用力也有助于螺旋内的碱基堆积成有 规律的疏水核心(3)离子键(盐键)：DNA分子在生理pH下带负电荷环境中带正电荷的Na+、K+、Mg2+、MM+等离子，原核生 物细胞内带正电荷的多胺类，真核细胞中带正电荷的组蛋 白等，均可与磷酸基团结合，消除静电斥力，对稳定核酸 的结构有重要的作用。B-DNA、A-DNA、Z-DNA2.DNA结构的多态性:A型 B型 Z型WatsonCrickDNA结构也称为 B型DNA,在生理条件下，B 型是最稳定的结构。ADNA仍为右手螺旋主要出现 在RNA-DNA杂交分子中；在原核和真核生物中存在一些 短片段的ZDNA。ZDNA为左 手螺旋在基因表达调控或遗传 重组中，可能有重要作用。(/，DNA的三级结构(超螺旋结构)1、DNA的三级结构：是指双螺旋DNA分子的扭曲或再 螺旋一一即超螺旋2、DNA的超螺旋结构(1)负超螺旋：对于环形DNA分子，或两端固定的 DNA分子，放松双螺旋后，则超螺旋的螺旋方向是右 手螺旋，称负超螺旋(2)正超螺旋：对于环形DNA分子，或两端固定的 DNA分子，旋紧双螺旋后，则超螺旋的螺旋方向是左手 螺旋，称正超螺旋。J（三）DNA与蛋白质复合物结构 真核细胞的DNA存在于染色质结构中 染色质的基本结构单位是核小体（核粒）核小体的 连接DNA核小体的 组蛋白核Core of 8 Histone Molecules由DNA分子在组蛋白核心 外面缠绕约两圈(1.75)根据所含碱性氨基酸的比例不 同，组蛋白分为Hl,H2A,H2B,H3和H4五类。核小体的核心含H2A、H2B、H3和H4各两分子。连接的DNA片段结合一分子H1一 锁住DNA“进、出口”。真核染色体组装一多级螺旋模型小公内久乂入乂/2nmllnm的核 小体“念 珠”3011m纤维3011m纤丝核骨架300nmj700nm1400nm1个亚诵CO并）DZA1个叱强 30个主攵谈名吉）1C-75 000强茬又寸）30 nm叁干空J55：&30nm纤维1400nm300nm钙立柒l l nm的核小体“念珠”蛋白质和DNA螺旋结构的主要差别（都以右手螺旋为主）蛋白质的a 螺旋DNA双螺旋1、单链1、双链2、中间为空心2、实心3、R基团伸向螺旋的外部3、碱基堆积在螺旋内部4、大多数为局部螺旋4、整个分子均为螺旋三、RNA的结构一级结构：单链线型分子二级结构：局部双螺旋（茎环结构多见）三级结构：二级结构基础上进一步折叠 四级结构：核蛋白复合物；RNA的一级结构由四种核甘酸（AMP、GMP、CMP、UMP）通过3,5-磷酸二酯键连接起来的直 线形多聚体。41HOHmRNA约占细胞总RNA的3%5%,数量少，但种类多；平均长度为1000-1500个核昔酸。7 J1、原核MRNA的结构特点(1)原核mRNA一般为多顺反子。即一条mRNA链上有多 个编码区。(2)每个顺反子编码区AUG之前有一段多喋吟区，称为SD序列(3)原核mRNA代谢很快，代谢半衰期一般以秒计，很 少达到l Omin以上。.编码区(4)结构模式:非编码间隔区-)非编码区非编码区2、真核MRNA的结构特点(1)真核mRNA都是单顺反子(2)真核mRNA 5，端有帽子结构，3,端有多聚腺昔 酸尾巴(Pol yA)(3)真核mRNA起始密码子AUG之前没有SD序列(4)真核mRNA代谢很慢，即代谢半衰期一般较长。如 兔珠蛋白mRNA可以存在几天。(5)结构模式:AUGUGA UAA UAGcap-5,非翻译区f编码区7-AA(A)n3,非翻译区 一Jj 真核生物MRNA的5,端帽子结构m7G5，ppp5，Np一称为0型帽子（末端核昔酸的核糖-21OH未甲基化）m7G5，ppp5NmPNp称为I型帽子（末端1个核昔酸的 核糖ZQH甲基化）m7G5 ppp5 NmpNmpNp-称为H型帽子（末端2个核昔酸的核糖，OH甲基化）真核生物成熟mRNA的两端均带有游离的3,OH。|型帽子-M7G5，PPP5，N】MPN2P帽子结构可能的作用：1、抗5。核昔酸外切酶降解作用。C2、在蛋白质合成中有助于核糖体对mRNA的识别和结 合，使翻译得以正确起始。7pol yA 尾3-端有一段约20-250核昔酸的pol yA。转录后由pol y(A)聚合酶催化加尾Pol yA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。pol yA与mRNA寿命有关，Pol yA大大提高 mRNA在胞质中的稳定性。J J i，二、RNA的二级结构1、tRNA的二级结构tRNA一般由70-90个核昔酸组成，平均沉降系数为 4S,分子较小；约占细胞RNA总量的15%TRNA的三叶草型二级结构主要特征：四环四臂1、氨基酸臂：携带氨基酸2、D环：识别氨酰tRNA合成 酶，相应的臂称为D臂。3、反密码子环：识别密码子 反密码子臂。4、可变环：分类的主要依据5、TOC环：与核糖体结合，因环中有TWC序列而得名 T巾C臂：U AGD cmGIGGCGUGUKCCACCUGCUC臂 酸 基 氨CA DA GGG cuccc2 t mG AGGGDG A可变环D环UUI1/m2TRNA的三级结构呈倒L型Amino核糖体由约40%的蛋白质和60%rRNA组成，rRNA占 细胞RNA总量的80%左右E.col i 16S rRNA的结构图13-20 16S和5S rRNA 的结构7原核生物和真核生物核糖体的比较原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA30S 70S50S16S5S23S40S 80S60S18S5S5.8S28S第四节核酸及核甘酸的性质、物理性质1、溶解性2、分子量3、形状及黏度二、紫外吸收性质 两类核酸的紫外吸收谱均为240290nm 其最高吸收峰接近260nm/3DNA的紫外吸收谱光吸收(A)0.437,.311是天然DNA;2是变性DNA；3是核甘酸总吸收值0.20199(24。26c 2X00 I波长/nm、/、1、鉴定DNA和RNA的纯度j纯的DNA：A260/A280应大于 18纯的RNA：A260/A280 大于20。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明 显降低。2、对纯核酸样品的定量测定只要测出260nm的A值，即可计算含量。通常以A值为1相当于50pg/mL双螺旋DNA,或40|tig/mL 单链 DNA（或 RNA）,或 20|tig/mL 寡核昔酸。核酸的紫外吸收与溶液的PH有关3三、核酸和核甘酸的两性解离胞喀咤碱基的解离：&上的电子云密度比较高胞喀咤上的烯醇式羟基与酚基类似，具有酸性，可以释放氢离子。因此在水溶液中胞喀咤的中性分子、阳离子和阴离子 O 之间处于一定的平衡关系。.7尿喀咤和胸腺喀咤不能进行碱性解离0 A(-ch3)尿甘酸、胸腺喀咤核甘酸不是 两性化合物(-CH3)No人N)H00HO-P-O-H2C 6h1N 0人NJ腺噂吟碱基的解离：N1上的电子云密度较高NH2产一4,eH+4n/、n/H 口鸟噫吟的解离：M上的电子云密度较高0鸟喋吟第六位烯醇式 羟基的95种核甘酸的解离常数(PK)：碱基烯醇式羟基第一磷酸基第二磷酸 基腺昔酸3.70.896.01鸟昔酸2.39.330.75.92胞甘酸4.240.85.97尿昔酸9.431.025.88胸腺昔酸10.01.66.5核昔酸分子中，由于糖和磷酸的存在，使碱基的解离变得容 易了pK值比游离碱基小。核昔酸的等电点：（以胞甘酸为例）pK：=0.8Qh+、pl=rki+pk2 2o-PK2f=4,24等电点时，带一负电荷 的磷酸基与带正电荷的 含氮环数目相等。核昔nh2酸的等电点偏酸性。nh2oO-p-o-h2c oOPK：=5.97 93 厂P-O-H2C OOH尿甘酸和胸腺嚅咤核甘酸不能出色兼性离子。核昔酸的解离曲线:核甘酸具有较强的 酸性，磷酸和碱基均能 发生解离。因此，核昔 酸为两性电解质。它们 在不同pH溶液中解离 程度不同，如图：尿甘酸、胸腺喀咤核 甘酸不能形成兼性离子。DNA等电点：4-4.5 RNA辱电点：2-2.5 核酸等电点偏酸，在中性及碱性溶液 中呈阴离子状态。妈驶14撇pK；=6.2 第二磷酸基4 5 6 7 8 9/PK尸3.7(pK；=0.9 含氯环,第一磷酸基 /p=2.4 含氮环第一磷酸基腺噤吟核甘酸pK6.1第二磷酸5/烯醉式羟基0050鸟噪吟核昔酸pH图14-1 核甘酸的解离曲线7四、核酸的变性、复性（一）核酸的变性 核酸的变性主要指DNA的变性。1.变性的概念注意与核酸降解的区另U：2.DNA的变性过程当引起核酸变性的因素(1)温度(热变性)(2)酸碱变性高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力,pH 11.3时,DNA完全变性,pH 5.0时，DNA易脱喋吟。(3)盐离子浓度DNA在l moI/L的NaCI溶液中稳定。在纯水溶液中易 变性。(4)变性剂(尿素，甲酰胺等)破坏氢键，妨碍碱基堆积。J4.变性后核酸性质的改变(1)生物活性丧失增色效应(3)黏度降低，浮力密度升高等浮力密度:通过用氯化钝等密度梯度离心法(平衡密度梯 度法)所求的高分子物质的密度。即介质密度代表 浮力密度。J5热变性的特点及TM值DNA变性的特点是爆发式的，变性作用发生-在一个很窄的温度范围内 o 1 30通常把DNA双螺旋结 s构失去一半时的温度称 1-为该DNA的熔解温度(Tm)或称熔点。”。DNA的Tm值一般在70 85 之间。100度36、影响TM的因素(1)DNA的均一性均一性愈高的样品，熔解过程 愈是发生在一个很小的范围内o(2)G-C对含量经验公式为：G-C%=(Tm-69.3)X2.24(3)溶液的离子强度(4)溶液的pH(5)变性剂J(二)核酸的复性(退火)1、含义：2、减色效应：3、影响复性速度的因素(1)单链片段浓度大，复性速度快。(2)较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。(3)片段内的重复序列多，容易形成互补区，复性较快。(4)维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥 力，可加快复性速度。（三）核酸的分子杂交基因X放射 自显影放射性标记的与 基因X互补的RNA 或DNA片段（探针）J琼脂糖凝胶长DNA片段短DNA片段x线胶片（2）洗膜（1）硝酸纤维膜与放射 性标记探针杂交（1）碱变性（2）转移,硝酸纤维膜单链DNA片段Southern EJ 迹法/五、核酸的酸解、碱解与酶解（一）酸解酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间长短而不同。用温和 的或稀的酸作短时间处理，DNA和RNA都不发生降解。但延长处理时间或 提高温度，或提高酸的强度，则会使核酸中的部分糖昔键发生水解，先 是喋吟碱基被水解下来，生成无嗦吟的核酸，同时少数磷酸二酯键也发 生水解，使链断裂。若用中等强度的酸在100下处理数小时，或用较 浓的酸（如261n oi/L HC1）处理，则可使喀咤碱基水解下来，更多的磷 酸二酯键断裂，核酸降解程度增加。3（二）碱解RNA在稀碱条件下很容易水解生成2二核昔酸和3,一核甘酸。0=P0CH2 0一0、，0pOH/.0 0037D核酸的酶解Efl详见“核酸的降解及核昔酸代谢”一章J第五节核酸的分离提取和纯化、核酸分离提取的一般原理和方法 DJ非活性核酸的制备I活性核酸的制备对于活性核酸的制备应防止降解和变性，要保持核酸 分子的完整性_P1871、避免剧烈搅拌或过多的溶液转移，以防核酸分子断裂。4 2、细胞破碎前加EDTA或SDS,防止胞内核酸酶的水解作用。、3、防止过酸过碱，以防核酸分子的降解。J核酸的分离提取大致包括：细胞破碎、胞内核酸酶 失活、目的核酸的分离几个步骤。J（一）DNA的分离制备1、利用DNP的溶解性分离DNPDNP是染色体DNA与组蛋白结合成的核蛋白。DNP溶于水和浓盐溶液（如Imol/L NaCI）,但不溶于生理盐溶液（0.14mol/L NaCI）2、DNP再以苯酚抽提，除去蛋白质（反复几次）（也可用氯仿异戊醇，或SDS）3、在有一定盐存在下，加二倍体积的冷乙醇，沉淀DNA,用乙酸或乙醇洗涤后干燥。4、DNA制品中的少量RNA用纯的RNase分解除去。（二）RNA的分离制备RNA要防止RNase的降解，注意如下三点：1、器皿要高温处理或用DEPC（0.1%焦碳酸二乙酯）除去RNase。2、破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase变性，或加热变性。3、RNA反应体系中加入RNase抑制剂目前常用的RNA分离方法：1、酸性服盐/苯酚/氯仿抽提2、用胭盐/氯化钝密度梯度离心二、核酸的纯化1、超速离心7分析DNA时，常用氯化钠密度梯度。(1)核酸密度的测定P186将DNA溶于8.0mol/L的氯化钠溶液中，置于离心管内，若以45 000转/分钟的速度离心16小时以上，即形成艳离子密度梯度，自底部的1&/加3到顶部的DNA形成一稳定 的区带，漂浮于等密度的位置上。(详见王镜岩三版)(2)测定DNA中G-C之含量GC碱基对比AT碱基对之密度大，所以含GC对多的DNA,浮力密度大。实验证明，GC的百分含量与DNA的浮力密度之 间呈正比关系。P=L66+0.00098(G+C)%(g/cm3)(3)溶液中核酸构象的研究双链DNA受热变性成为单链后，浮力密度增高。(4)用于核酸的制备应用漠化乙锭-氯化艳密度 梯度平衡超速离心，可以 将不同构象的DNA,RNA及 蛋白质分开。这个方法是 目前实验室中纯化质粒DNA 时最常用的方法。/C凝胶电泳常用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。由于琼脂糖制品中 往往带有核糖核酸酶杂质，所以用于分析RNA时，必 须加入蛋白质变性剂，如甲醛等。聚丙烯酰胺凝胶孔径比琼脂糖凝胶要小,所以可用于 分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA的 电泳。聚丙烯酰胺凝胶中一般不含有RNase,用于RNA的分析不会分解样品。l3、柱层析纯化天然DNA可用羟基磷灰石（HA）作层析剂 HA吸附双链DNA能力大于单链DNA,而且不吸附 RNA和蛋白质。分离带有pol yA的mRNA可以用寡聚（dT）n-纤维素 亲和层析法或寡聚尿喀咤核昔酸（pol yU）-琼 脂糖亲和层析。