大肠杆菌.ppt

小组成员 分工 包 升 制作PPT 冯 宇 讲解PPT 李春雷 查找并整理第一部分资料 刘 磊 查找并整理第一、五部分资料 王 鹏 查找并整理第二、三部分资料 熊志江 查找并整理第四部分资料大肠杆菌（Escherichia coli）1.第二部分遗传物质第三部分基因突变及修复目录第四部分基因转移及重组第五部分研究应用第一部分概述2.2024/5/22 周三概述一、形态特征：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，大小约0.4-0.7m2.0-3.0m，两端钝圆，多单独存在或成双，但不呈长链状排列。大多数菌株具有周生鞭毛而能运动，有的菌株具有荚膜或微荚膜，不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好。二、培养特性：大肠杆菌为兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度37，最适生长pH7.2-7.4大肠杆菌与沙门氏菌在鉴别培养基上的菌落特征细菌培养基麦康凯培养基伊红美蓝培养基SS培养基三糖铁琼脂斜面大肠杆菌红色紫黑色带金属光泽红色斜面黄色，底层变黄有气泡，不产生H2S沙门氏菌淡桔红色较小无色透明淡红色、半透明，产H2S菌株菌落中心有黑点斜面红色、底层变黄、有气泡、部分菌株产H2S伊红美蓝培养基上产生黑色带金属闪光的菌落2电镜下的大肠杆菌3.2024/5/22 周三大肠杆菌与沙门氏菌生化试验鉴别表实验类别 葡萄糖乳糖麦芽糖 甘露醇 蔗糖吲哚试验（IDN）MR试验VP试验枸橘酸盐（CIT）H2S动力(MOT)大肠杆菌/-V+-+沙门氏菌-+/-+/-注：产酸产气；+：阳性；-：阴性；+/-：大多数菌株阳性/少数阴性；V：种间有不同反应。三、生化特性：普通营养琼脂上生长24h后，形成圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色、中等大小菌落。微生物资源数据库共享平台 菌株保藏编号 NKCCMR NK 7.C 7037大肠杆菌在麦康凯培养基上长成红色菌落概述34.2024/5/22 周三致病性大肠杆菌肠道致病性大肠杆菌含粘附素和肠毒素等、可分泌具有细胞毒性的（类）志贺毒素主要引起非炎症性腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征等肠道外致病性大肠杆菌主要引致败血症以及尿道、生殖道、乳腺等感染四、致病性：五、微生物诊断：从可疑症状着手分析，再采集病变组织或者收集粪便或肠内容物，划线接种于麦康凯或伊红美蓝琼脂平板上，挑取可疑菌落同时接种于TSI琼脂和普通琼脂斜面，然后革兰氏染色、镜检形态，淘汰不符合者，最后做生化试验；也可用多重PCR法检测细菌的特异性基因。概述45.2024/5/22 周三5E.coli基因组中还包含有许多插入序列，这些插入的片段都是由基因的水平转移和基因重组而形成的。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。具有不同基因型的菌株表现出不同的特性。大肠杆菌环状遗传图一、基因组：大 肠 杆 菌(Escherichia coli，E.coli)染色体基因组是研究最清楚的基因组。大肠杆菌K12基因组大小为4.6 106bp，共有4288个基因，基因的平均长度是951bp。大肠杆菌染色体基因组中，大多数rRNA基因集中于基因组的复制起点oriC的位置附近。遗传物质6.2024/5/22 周三遗传物质6与基因重组相关的基因型recA、recB、recC等与甲基化相关的基因型dam、dcm、mcrA、mcrB和C、mrr、hsdM等与点突变相关的基因型mutS、mutT、dut、ung、uvrB等与核酸内切酶相关的基因型hsdR、hsdS、endA等与终止密码子相关的基因型supE、supF等与抗药性相关的基因型gyrA、rpsL、Tn5、Tn10等与能量代谢相关的基因型lacZ、lacZ M15、lacl q、ara、mtl、xyl、gal、srl等与氨基酸代谢相关的基因型gpt、thyA、asd、leuB、proA、proB、trpR、lys、metB、cysB、thr等与维生素代谢等相关的基因型bioH、thi等与蛋白酶相关的基因型Lon、ompT等与物质转运结合相关的基因型tonA=fhuA、tsx、cysA等其他deoR、traD、hflC、minA、B、relA、glnV、tyrT等二、主要基因型：7.2024/5/22 周三遗传物质7染色体的结构电镜观察大肠杆菌的染色体，可见是一团具有许多环状螺旋结构的DNA大分子，中央有一骨架，其周围附着有30-50个超螺旋的环，环的长度约为20nm，每个DNA环中的DNA都是负超螺旋。DNA的复制大肠杆菌的染色体复制需要DNA聚合酶、引物酶及其他与复制有关的蛋白质。复制起点是oriC位于大肠杆菌遗传图84.3min处。DNA按型方式进行双向等速复制，分为起始、延伸和终止三个阶段。三、染色体：8.2024/5/22 周三8基因突变及修复在基因突变研究中，大肠杆菌、沙门菌等一直是研究的极佳材料，因为它们只有一条染色体，其遗传物质的改变而导致的表型可立即表现出来。大肠杆菌中还存在修复系统，可以恢复不同的DNA损伤。突变类型：自发突变：自然条件下产生的突变。在进行DNA自我复制时，在基因突变与基因修复的共同作用下发生突变。适应突变：在非致死条件下，延长培养时间细胞发生的一种使自身适应环境的自发突变。诱变：人为选择某些可强烈地影响DNA结构的诱变剂处理引发的突变。一、基因突变：大肠杆菌的Uvr修复系统大肠杆菌的UvrABC核酸内切酶能对损伤的DNA进行识别和切割。uvrA、uvrB、uvrC基因共同编码UvrABC核酸内切酶。二、DNA修复：9.2024/5/22 周三9基因基因产物的功能uvrADNA结合蛋白uvrB与uvrA结合后再与DNA结合成复合体，在损伤DNA的3末端造成缺口uvrC与uvrB结合成复合体，在损伤DNA的5末端造成缺口uvrD帮助移去含有损伤的寡核苷酸DNA聚合酶I填充单链缺口连接酶封合单链缺口大肠杆菌的SOS修复系统细胞损伤时，参与DNA修复的基因，包括切除修复基因（uvrA、uvrB、uvrC）、重组修复基因（recA）及其他基因（umuC、umuD）。OS修复主要通过增加切除修复酶和重组修复酶的含量，来增强对损伤DNA的修复。正常细胞中，LexA阻遏蛋白与lexA、recA、uvrA、uvrB、uvrC基因的操纵区结合，阻遏它们表达，只合成少量RecA蛋白和修复酶，修复零星的DNA损伤。大肠杆菌受到UV照射后，产生大量二聚体，出现大量单链DNA部位，与细胞内少量RecA蛋白结合，激活其蛋白酶功能，使LexA阻遏蛋白自我切割，并且促进DNA同源配对。基因突变及修复10.2024/5/22 周三大肠杆菌甲基化介导的错配修复系统 特异性不强，基本能修复DNA双链结构中任何轻微的损伤，包括错配、移码、碱基类似物的替代等。基因突变及修复10大肠杆菌错配修复机制模式步骤：组 成：MutS、MutL、MutH、dam基 因、UvrD、核 酸 外 切 酶（ExoI、Exo 、RecJ和Exo）、单链结合蛋白（SSB）、DNA聚合酶、DNA链接酶。dam基因编码Dam甲基化酶，使GATC/CTAG序列中的A甲基化。在这个修复系统中，缺口是由DNA聚合酶合成的，而其他大多数修复反应都依靠DNA聚合酶 或聚合酶。11.2024/5/22 周三11基因转移及重组一、转化：供体和受体质粒结果F+F-2F+HfrF-Hfr+F-F F-Hfr供体细胞与受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。F质粒与接合作用F+:细胞内含F质粒，以自主复制形式存在；F-:细胞内不含F质粒；F:携带了宿主的一部分染色体的F质粒；Hfr :F质粒通过同源重组整合到宿主的染色体上，随着宿主染色体复制而复制。大肠杆菌的接合二、接合：12.2024/5/22 周三12基因转移及重组局限性转导：被转导的DNA片段仅仅是靠近染色体溶源化位点的基因。噬菌体：只转导gal和bio基因。携带gal基因的转导噬菌体称为dgal或dg，携带bio基因的转导噬菌体称为dbio或db。（d表示缺陷）80噬菌体：80整合部位靠近色氨酸基因（trp），可用 80dt转导噬菌体对基因trp进行转导。三、转导：利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移到受体菌内的现象。普遍性转导：任何供体的染色体都可以转移到受体细胞。大肠杆菌的P1普遍性转导噬菌体其pac位点的特异性比其他噬菌体低，以“headful”包装机制进行包装，能有效包装宿主DNA片段。P1噬菌体的宿主范围较广，能将大肠杆菌的DNA转导到其他许多G-细菌中。浸染P1供体裂解收集子代噬菌体浸染受 体（缺陷型E.coli）菌苔计数噬菌斑（完全培养基）选出重组子（转导子）（基本培养基）转导频率计算：13.2024/5/22 周三13基因转移及重组注：Holliday模型，是第一个被广泛接受的重组模型，它是通过要发生重组的2个DNA分子的2条单链在同一部位断裂，断裂的游离末端彼此交换形成异源双链，然后2条杂合单链彼此连接形成Holliday连接体。Holliday连接体是所有重组模型的核心。过程分为四个阶段起始阶段（RecBCD酶）RecBCD酶能以相当高的频率启动含有Chi()位点的DNA重组。(为顺式作用重组位点)链侵入、同源配对和Holliday结构的形成（RecA蛋白质）RecA酶结合于粘性末端的3端后，凝集，形成稳定的丝状复合物。并启动其结合的DNA与双链DNA纵向配对，形成RecA-单链DNA-双链DNA三元复合物。随后双链DNA解旋，单链DNA便与之进行同源区的配对，将双链DNA中的同源单链置换出来，自己与互补链配对，形成D-环。非同源区(异源双链)的扩展（RuvAB）RuvA和RuvB蛋白复合体在Holliday结构形成后促进分支迁移。Holliday连接体的切割ruvC编码的RuvC蛋白质能特异识别Holliday结构且在体外将Holliday的交叉结构切开。四、同源重组：14.2024/5/22 周三14研究应用 大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。真核基因在大肠杆菌中表达，必须有合适的表达载体(Vector),常用载体：pBV220,pET系统。二、应用：一、研究：大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌，作为一种模式生物，其基因组序列已全部测出。用分子生物学方法在大肠杆菌得出的结论可用于其它生物的研究。15.2024/5/22 周三谢谢观看16.2024/5/22 周三