微生物实验-细菌的人工培养及形态学检查-PPT.ppt
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1、微生物学与免疫学教研室【基本要求基本要求】1.进微生物实验室必须穿好白大衣,离室需脱下反折。2.实验无关物品一律禁止带入实验室。严禁在实验室进食、饮水和喧哗打闹。3.手拿培养物后或出实验室前要洗手;避免有菌材料溅出;破损器材及时处理并报告。4.实验操作过程中产生的废料要扔在指定容器内;实验完毕清理台面,值日生认真打扫卫生,关闭水电,门窗,洗手后离开实验室。21.1.实验室生物安全;实验室生物安全;“有菌意识,无菌操有菌意识,无菌操作观念作观念”的树立。的树立。2 2.细菌的人工培养以及细菌的形态学检查细菌的人工培养以及细菌的形态学检查(革兰染色)。(革兰染色)。3 3.细菌在自然界的分布,消毒
2、灭菌及理化细菌在自然界的分布,消毒灭菌及理化因素对细菌的影响。因素对细菌的影响。内 容细菌的人工培养菌的人工培养细菌生菌生长繁殖繁殖所需要的条件所需要的条件充足的充足的营养养适宜的温度适宜的温度嗜冷菌嗜冷菌嗜温菌嗜温菌 病原菌病原菌37嗜嗜热菌菌合适的合适的PH值嗜酸菌嗜酸菌嗜中性嗜中性细菌菌病原菌病原菌7.27.6嗜碱菌嗜碱菌必需的气体必需的气体环境境根据根据细菌代菌代谢是是对分子氧的需要与否分子氧的需要与否专性需氧菌性需氧菌微需氧菌微需氧菌兼性兼性厌氧菌氧菌专性性厌氧菌氧菌二、二、细菌的人工培养菌的人工培养 培养培养细菌的目的,是从不菌的目的,是从不纯的被的被检材料材料中找出特定的中找出特
3、定的细菌或全部菌或全部细菌,菌,这一一过程程称称为分离培养。如果只是培养性分离培养。如果只是培养性质明确的明确的一种一种细菌,菌,则称称为纯培养。培养。为了从被了从被检材材料中分离出所要料中分离出所要检查的的细菌,可以利用多菌,可以利用多种性种性质不同的不同的选择性培养基,性培养基,检查各种不各种不同的目的同的目的细菌。菌。细菌的培养基:菌的培养基:(一)培养基的定义:培养基是人工方法配制的含有细菌生长繁殖所需物质的营养基质。其必须本身无菌,一般PH调至7.27.6。营养物质营养物质水水碳源碳源氮源氮源无机盐无机盐生长生长因子因子(二)制备原则:1.调配营养物质:蛋白胨(氮源),牛肉膏,氯化钠
4、,蒸馏水。2.调配PH:加入缓冲剂,保持PH稳定。3.消毒灭菌。满足a充足的营养物质b合适的PH值c无菌就可制成基基础培养基培养基液体培养基液体培养基+1.51.5 2.52.5%琼脂脂固体培养基固体培养基+0.30.3 0.50.5%琼脂脂半固体培养基半固体培养基(三)分(三)分类:1、按物理性状按物理性状分分类:大量繁殖细菌观察细菌动力短期保存菌种细菌的分离和纯化 液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基 固体固体固体固体斜面培养基斜面培养基斜面培养基斜面培养基 半固体培养基半固体培养基半固体培养基半固体培养基固体平板培养基固体平板培养基固体平板培养基固体平板培养基2、按用途分:、按用途分
5、:(1).基础培养基:含有大多数细菌生长所需要的基本营养成分。最常用的为肉汤培养基(2).增菌培养基:在基础培养基中添加生长因子(eg:血清等)或微量元素等其他营养物质或特殊抑制剂。如血平板:5-10%脱纤维羊/兔血,(60C左右加入血)。巧克力平板:80C左右加入血。(3).选择培养基:培养基中加入某种/些化学物质,能抑制某类细菌生长而使另一类细菌生长,从而将后者选择出来。常用于肠道致病菌的分离与选择培养。(4).厌氧培养基:用于厌氧菌的分离、培养和鉴定。血平板巧克力平板MacConkey平板X.L.D平板Sabourand平板Mycosel平板几种常用培养基几种常用培养基(5).鉴别培养基
6、:根据各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及代谢产物不同,在培养基中加入底物和指示剂来鉴别细菌。1)蓝色半固体培养基2)无色半固体培养基3)基础液体培养基(溴麝香草酚蓝)(醋酸铅)鉴别培养基鉴别培养基细菌动力鉴别细菌生化反应鉴别三、各种培养基的接种三、各种培养基的接种在医疗实践中或微生物试验中防止周围环境中的微生物污染操作染操作对象象,同时防止操作对象的微生物污染周染周围环境。境。1.四种接种方式:接种针用于穿刺接种细菌(半固体培养基),接种环用于固体、液体培养基的细菌接种。(相(相对无菌)无菌)2.任何一个实验,操作前均应在器皿上做标记:时间,菌种,菌种,组别。培养皿一般标记在皿底。一)无菌操作无
7、菌操作接种环的灼烧灭菌先将先将环端端烧热,将接种,将接种环提起垂直放在火焰上,提起垂直放在火焰上,烧红,环斜放,沿斜放,沿环向上,至金属杆,再移向向上,至金属杆,再移向环端。端。来回通来回通过火焰火焰3次,冷却。次,冷却。3接种。注意接种。注意:整个:整个实验操作操作过程都要程都要非常小心,不要碰翻酒精灯,以免非常小心,不要碰翻酒精灯,以免烧伤。(1)用左手大姆指、)用左手大姆指、食指、食指、中指和无名指拿住中指和无名指拿住菌种菌种试管,管,右手右手拧松棉塞、不取下松棉塞、不取下。接种管宜放在菌种管上面(2)右手拿接种)右手拿接种环,在,在火焰上火焰上烧灼灼灭菌,特菌,特别是是箍箍处。(3)火
8、焰)火焰边取下两个棉取下两个棉塞,不能放下;塞,不能放下;烧灼管灼管口一周。口一周。(4)将接种)将接种环伸入伸入试管管内,冷却后,内,冷却后,轻轻挑取挑取少量菌体,立即将接种少量菌体,立即将接种环抽出。抽出。(6)抽出接种)抽出接种环后,后,烧管口,塞棉塞,接管口,塞棉塞,接种种环灭菌。菌。(5)火焰旁将沾有菌种的)火焰旁将沾有菌种的接种接种环迅速伸到斜面培养基迅速伸到斜面培养基的底部,由里向外画蛇形的底部,由里向外画蛇形细线,线要画得要画得细些。些。(二)(二)接种方法接种方法1.平板划平板划线接种法:接种法:目的:使混合的细菌呈单个分散生长,形成单个菌落,以便获得纯菌。方法:1)连续划线
9、法:适用于样本含细菌量少,如血液标本2)分区划线法:适用于含菌量较多的标本,如粪便标本固体平板培养基固体平板培养基一旦划破,会造成划线不均匀,难以达到分离单菌落的目的;二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落,菌落会沿着划破处生长,会形成一个条状的菌落。2.固体斜面培养基接种法:固体斜面培养基接种法:作用:观察细菌的培养特性、生化反应、保存菌种。接种方法:连续划线法。生长现象:呈菌苔样生长。3.半固体培养基半固体培养基接种法:接种法:11作用:检测细菌动力、生化反应接种方法:接种针穿刺法-用接种针中央直刺,一条线路,底部留空生长现象:沿穿刺线生长-无动力沿穿刺线扩散生长(呈云雾状或羽毛状)
10、-有动力4.液体培养基液体培养基接种法接种法作用:增菌及检测生化反应。接种方法:研磨接种。生长现象:浑浊、沉淀、菌膜样生长。细菌培养法菌培养法一般培养(需氧培养):培养温度:37(采用恒温培养箱)培养时间:1824h实验一一 细菌的人工培养菌的人工培养一、一、细菌在自然界的分布菌在自然界的分布1.空气中细菌的检查:每班两个血平板,标记方法方法:在室内选择一处放一个平皿,揭开皿盖,暴露放置10min,即盖上皿盖,放入37温箱培养24小时,观察结果。2.人体表面细菌的检查-手指(每组1个平皿)方法:取一普通平皿培养基,一部分标记“前前”,另一部分标记“后后”,然后将手指在标记“前前”的部分沾一下,
11、洗手后洗手后在标记“后后”的部分沾一下。放入37温箱培养24h后观察细菌的生长情况。3.人体内部细菌的检查-咽喉部方法方法:用“咳碟法”进行检查,取一个血琼脂平皿培养基,打开平皿盖,置于口腔前约10cm,对着平皿咳嗽几次,标记时间,姓名,然后放入37温箱培养24h后观察菌落特征。二、外界因素二、外界因素对细菌的影响:菌的影响:1.物理因素对细菌的影响:紫外线:全班两份普通平板:一组大肠杆菌,一组葡萄球菌,比较紫外线对G+,G-的抑制作用。方法:取普通琼脂平皿,用用密集划线法接种细菌,然后将平皿盖遮盖一半一半,用紫外线照射30min,然后放入37温箱中孵育24h后观察。2.化学消毒剂:每组普通平
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