免疫学检测技术ppt.ppt
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1、第十四章 免疫学检测技术抗原和抗体可以发生高度专一性的结合 抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原或抗体检测原理:抗原或抗体检测原理:借助抗原和抗体在体外特异结合后抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象,对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。Equivalence Lattice formation抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原或抗体检测原理抗原或抗体检测原理免疫学免疫学(Immunology):是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应答的规律及免疫应答的调节的一门科学。答的规律及免疫应答的调节的一门科学。免疫的定义免
2、疫的定义(Immunity):免疫是机体识免疫是机体识别自我与非自我的过程。排除异己,维护别自我与非自我的过程。排除异己,维护自身稳定的生理反应。自身稳定的生理反应。免疫的功能:免疫的功能:1.抵抗感染(抵抗感染(Defense):机体能抵抗病原微生物):机体能抵抗病原微生物侵袭的能力。又称免疫防御。侵袭的能力。又称免疫防御。抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫2.自身稳定(自身稳定(Homeostasis):机体在新陈代谢过):机体在新陈代谢过程中,产生大量的衰老死亡细胞,免疫的第二个功能程中,产生大量的衰老死亡细胞,免疫的第二个功能就是清除这些细胞,维持机体
3、的生理平衡。就是清除这些细胞,维持机体的生理平衡。3.免免 疫监视(疫监视(Immunological surveillance):机):机体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响,使体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响,使细胞发生癌变,形成肿瘤等,机体可识别、清除这些细胞发生癌变,形成肿瘤等,机体可识别、清除这些细胞,这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下细胞,这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下或失调时,会导致肿瘤或癌症。或失调时,会导致肿瘤或癌症。抗原抗原 (Antigen)抗原概念抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞,凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞
4、,并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反应的物质。反应的物质。抗原性抗原性(Antigenicity):包括免疫原性和反应原性):包括免疫原性和反应原性二个方面二个方面免疫原性:抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细免疫原性:抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的性能。胞的性能。反应原性:抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体反应原性:抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反内或体外发生反 应的性能。应的性能。抗原抗原 (Antigen)构成抗原的条件构成抗原的条件1.异物性:机体免疫细胞能识别自身和异己物质,异物性:机体免疫细胞能识别自身和
5、异己物质,只只有外源性的物质才具有免疫原性,产生免疫反应。有外源性的物质才具有免疫原性,产生免疫反应。亲缘关系越远,差异越大,抗原性越强。亲缘关系越远,差异越大,抗原性越强。自身抗原:自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体自身抗原:自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白2.大分子胶体:一般在大分子胶体:一般在10 kD以上以上。3.具有复杂的立体结构或空间构象具有复杂的立体结构或空间构象.如明胶分子量虽然为如明胶分子量虽然为100 kD,但结构简单,免疫原性差。,但结构简单,免疫原性差。抗原如何被识别抗原如何被识别抗原的特异性抗原
6、的特异性 抗原决定簇:抗原分子表面具有免疫活抗原决定簇:抗原分子表面具有免疫活性的化学基因性的化学基因,是抗原与抗体结合的部位。是抗原与抗体结合的部位。抗原分子中抗原的特异性由抗原分子中抗原的特异性由抗原决定簇抗原决定簇决定。决定。一种细菌可以刺激多少种抗体产生?抗原抗原一种细菌可以刺激多少种抗体产生?根据抗原的化学性质分:根据抗原的化学性质分:天然抗原:微生物及其产物抗原如天然抗原:微生物及其产物抗原如菌体抗原(菌体抗原(O 抗原)抗原)鞭毛抗原(鞭毛抗原(H 抗原)抗原)表面抗原(如大肠杆菌的表面抗原(如大肠杆菌的K 抗原)抗原)细菌的毒素抗原细菌的毒素抗原病毒抗原(病毒抗原(V 抗原)抗
7、原)人工抗原:人工合成多肽、蛋白等人工抗原:人工合成多肽、蛋白等抗体(抗体(Antibody)一、概念一、概念 是抗原刺激是抗原刺激B淋巴细胞淋巴细胞,使之增殖分化成使之增殖分化成浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)抗体(抗体(Antibody)一、概念一、概念二、免疫球蛋白的基本结构二、免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白:在人和动物血液、组织液及其免疫球蛋白:在人和动物血液、组织液及其他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。1.由由4 条肽链组成:条肽链组成:2 条重链,
8、条重链,2 条轻链条轻链2.一个抗体单分子:一个抗体单分子:2 个抗原结合位点个抗原结合位点抗体(抗体(Antibody)抗体(抗体(Antibody,Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白质,是抗体免疫球蛋白是一种蛋白质,是抗体(Ab1);同时又可引起机体产生抗体(抗抗体;同时又可引起机体产生抗体(抗抗体,Ab2),所以既是),所以既是抗体又是抗原抗体又是抗原。Ag Ab1 Ab2 抗体(抗体(Antibody,Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能 1.与抗原结合与抗原结合 2.激活补体激活补体 3.组织结合组织结合 4.调理作
9、用调理作用 5.抗体依赖细胞介导的细胞毒作用抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能抗体(抗体(Antibody)的产生与功能的产生与功能抗体产生的主要过程抗体抗体抗体抗体注射注射注射注射抗原抗原(如类毒素)(如类毒素)血清血清抗体?抗体?抗体?抗体?抗原?抗原?抗原?抗原?抗体的制备抗体的制备抗体的制备抗体的制备抗血清:指抗原人工免疫实验动物,获得含抗血清:指抗原人工免疫实验动物,获得含 特异性抗体的血清。特异性抗体的血清。多克隆抗体多克隆抗体 (PAb)(PAb):多个抗原决定簇免疫机体多个抗原决定簇免疫机体 所产生的多种抗体的混合物。所产生的多种抗体的混合
10、物。单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibodymonoclonal antibody,MAbMAb):只针对某一特定的抗原决定簇,纯度高的抗体。只针对某一特定的抗原决定簇,纯度高的抗体。多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体的制备多克隆抗体与单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 脾脏淋巴细胞脾脏淋巴细胞 (HGPRT-TK-)HGPRT-TK-)(HGPRT+TK+HGPRT+TK+)在在HATHAT中不能生长中不能生长 体外培养过程中死亡体外培养过程中死亡 PEGPEG 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 (HGPRT+(HG
11、PRT+、TK+)TK+)在在HATHAT中大量长期繁殖中大量长期繁殖 克隆化克隆化 产生单抗产生单抗 第一节 免疫学检测技术原理抗原或抗体检测原理:抗原抗体的结合具有高度专一性抗原抗体的结合具有高度专一性 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象,对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理 Ab excessAg excessEquivalence Lattice formation对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理 根据抗原抗体形成的免疫复合物的浓度进行定量检测。P 312第一节 免疫学检测技术原理可作为抗原进行检查的物质:l 微生物及其大分子产
12、物l 人和动物细胞l 人和动物体内的各种大分子l 各种半抗原抗原或抗体检测原理抗原或抗体检测原理较早的抗原抗体反应检测方法较早的抗原抗体反应检测方法1、凝集反应、凝集反应 (Agglutination)2、沉淀反应、沉淀反应 (Precipitation)3、补体结合试验、补体结合试验 (Complement fixation test)4、中和试验、中和试验 (Neutralization test)一、凝聚反应一、凝聚反应(Agglutination)(Agglutination)二、沉淀反应二、沉淀反应 1 1、溶液中的沉淀反应、溶液中的沉淀反应 2 2、凝胶扩散沉淀、凝胶扩散沉淀 3
13、3、免疫电泳、免疫电泳 血清免疫电泳血清免疫电泳 火箭电泳火箭电泳 对流免疫电泳对流免疫电泳 三、补体参与的反应三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术四、免疫标记的抗原抗体技术 酶联免疫吸附(酶联免疫吸附(ELISAELISA)一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合,在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原,抗体称为凝集素。一、凝集反应 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合,在一定条件下出现凝集。二、沉淀反应 当抗原是可溶性分子时,与抗体
14、结合则形成沉淀。1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原,在中性条件下37度保温1-2h,便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例,检测抗原抗体的分子比。2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后,小心加入相应抗原,使抗原抗体步混合,37度保温10-20min,在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。3、双向扩散:又称琼脂扩散,是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。琼脂是多孔的网状结构,可使大分子物质通过,分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇,比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多
15、种体系时,会出现多条沉淀弧。二、沉淀反应双向扩散法的操作:生理盐水配制1%-5%的琼脂,取4mL倒在普通载玻片上,凝固后打孔,中心孔滴入抗原,外周孔滴入抗体用于测定抗体效价,中心孔滴入抗体,外周孔滴入抗原,用于检测抗原的存在和定性抗原。二、沉淀反应 抗原抗体为单一体系时,抗原浓度不同,沉淀弧的特征不同:抗原抗体为多体系时,出现的沉淀弧有多条,彼此互不干扰。4、单向免疫扩散:又称单向琼脂扩散,是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体,孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中,孔内的抗原向周围扩散,与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量二、沉淀反应二、沉淀
16、反应 另外还有其他众多的免疫检测技术和手段,其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳火箭电泳等。免疫电泳二、抗原或抗体检测的现代方法:P3121.免疫荧光技术2.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法第一节免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法:1.免疫荧光技术 将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和罗丹明(和罗丹明(rhodamine B200,RB20
17、0)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合,在蓝紫光激发下,可分别出现鲜明的氨基结合,在蓝紫光激发下,可分别出现鲜明的黄绿色及玫瑰红色。的黄绿色及玫瑰红色。第一节 免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的方法:1.免疫荧光技术n直接荧光法n 间接荧光法 第一节 免疫学检测技术原理二、抗原或抗体检测的现代方法:P3132.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用 一、基本原理:将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记,试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后,测定复合物中的荧光素,这种免疫技术,称为免疫荧光素技术免疫荧光素技术。第二节 免疫荧光技
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