第二章生物制药工艺技术基础2.ppt

4、生长因子、生长因子一类对微生物正正常常代代谢谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源碳源或氮源自行合成的有机物。需要量很少，例如各种维维生生素素、碱碱基基、卟卟啉啉、甾甾醇醇等。不同种类微生物对生长因子并并非非都都须须外外界界供供给的给的。多数真真菌菌、放放线线菌菌和和不不少少细细菌菌，都不需要外界提提供生长因子供生长因子；少数微生物还能自自行行合合成成过过量量的的生生长长因因子子分分泌泌到到环境中环境中，因此可用作维生素的生产菌种生产菌种。钳兜堑晦畜裔阻代介仑莽炼修骄槐话肿巳帐讥亮屡病沧码锯撼匆跳砾欲据第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础25、无机盐、无机盐除碳碳、氮氮元元素素以外，对微生物生长繁殖所必需的无无机机物物中中的的元元素素，如磷磷、硫硫、钾钾、镁镁、钠钠、铁铁和和锌锌、锰、钼、钴、铜锰、钼、钴、铜等。6、水、水水是微生物一切生命活动赖以进行的基本条件，虽较少用作真正的营养物，但因其不能缺少，故故也也属营养素之一属营养素之一。轻推粹蚌虑弹去缝晴倚匈澡掳獭甭段组厦亨妈鲜格阐锗唾井瘩玄宵怔住荧第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（二）微生物培养基（二）微生物培养基培培养养基基是人工配制的适合于不同微生物生生长长繁繁殖殖或或产产生生代代谢谢产产物物的营养基质。它是微生物的营养基础，是合成代谢产物的物质来源合成代谢产物的物质来源。培养基成成分分和和配配比比合适与否，对微生物生生长长发发育育、物物质质代代谢谢、发发酵酵产产物物的的积积累累以以及及生生产产工工艺艺等都有很大的影响。一种良好培养基的确定，往往要经过长长期期的的反反复复的试验，并不断调整改进的试验，并不断调整改进，逐渐趋于完善。同时，应根据菌菌种种特特性性、发发酵酵条条件件和和工工艺艺的的改改变变进行相应的调整、改善相应的调整、改善。哼蛾鬼捧华棠茎绦工荷注揩阻羌脱伍偏桥袭励蔡隐凳孺荷铁嗡捶沪纤垢堕第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2除培养基组成外，还需考虑其其他他培培养养条条件件的的控控制制，才能发挥其最大效能最大效能。任何培养基都应具备微生物生长所需要的6大大营营养养要要素素，即碳碳源源、氮氮源源、能能源源、无无机机盐盐、生生长长因因子子和和水水。在发酵过程中，为提高产物的量或减少杂质的生成，有时还添加前体、诱导物或抑制剂前体、诱导物或抑制剂等成分。培养基配好后必须立即进进行行灭灭菌菌，否则会因杂杂菌菌生长生长而破坏其固有成分和性质固有成分和性质。晋泄戮泰瓤疽赌籽佛熬项矮桌村军祟哗什陕机疼缴迟初撤浩格中浙哗庚洼第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础21、培养基的种类、培养基的种类培养基按其组成物质的来源可分为合合成成培培养养基基和和天天然然培培养养基基，前者所用原料的化化学学成成分分明明确确、稳稳定定，但但营营养养单单一一且且价价格格昂昂贵贵，适用于研研究究菌菌种种基基本本代代谢谢和和过程的物质变化过程的物质变化，不适用于大规模工业生产。发发酵酵工工业业普遍使用天然培养基，它的原料是一些天然的动植物产品，如花生饼粉、酵母膏、蛋白胨花生饼粉、酵母膏、蛋白胨等。天天然然培培养养基基的的特特点点是营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。一一般般天天然然培培养养基基中中不不需需要要另另加加微微量量元元素素、维维生生素素等等物物质质，而且组成培养基的原料来来源源丰丰富富，价价格格低低廉廉，适用于工业生产。稍恭屉灶僻缺秘迸淮诗探鞘窗棍渤弯俞杏劲坊际询轨奥缩玄杰湛贞赵拧蚊第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2培养基按状态可分为固固体体培培养养基基、半半固固体体培培养养基基和液体培养基和液体培养基。固体培养基固体培养基比较适用于菌种的分离和保存分离和保存。半半固固体体培培养养基基即在配好的液体培养基中加入少量琼脂，一般用量为0508，培养基即呈半固体状态，主要用于鉴鉴定定菌菌种种、观观察察细细菌菌运运动动特特征征及及噬噬菌菌体的效价测定体的效价测定等。液液体体培培养养基基中的8090是是水水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递有利于氧和物质的传递。紧混舷肮泵瞎率肪遏贡跨扛瓮秦草涂送崖某撇诱蛀燕倚擒哭巫子膜步尤纺第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2培养基按其用途一般可分为孢孢子子培培养养基基、种种子子培培养基和发酵培养基养基和发酵培养基三种。孢孢子子培培养养基基是供菌种繁殖孢子的一种常用的固体培养基。这种培养基的要求是能使菌菌体体迅迅速速生生长长，产生较多优质孢子优质孢子并不易引起菌种发生变异变异。种种子子培培养养基基一般指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基，这种培养基主要含含有有容容易易被被利利用用的的碳碳源源、氮氮源源、无无机机盐盐等，使孢孢子子很很快快发发芽芽、生生长长以以及及大大量量繁繁殖殖菌菌丝丝体体，并使菌体长得粗粗壮壮和使各种有关的初初级级代代谢酶的活力提高谢酶的活力提高。种子培养基要和发酵培养基相适应，成成分分不不应应相相差差太大太大，以避免种子对新环境的适应时间延长适应时间延长。赏讫蕊宣鸡活先括醛笆酣偏酶姨倒惶矩矫丑隅腥解话熄牲隧犁凑蕴妹卓笑第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2发发酵酵培培养养基基可供菌种生生长长、繁繁殖殖和和合合成成产产物物。它既要使种子接种后能迅迅速速生生长长达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅迅速速合合成成所所需需的的产产物物，因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必必需需的的元元素素和和化化合合物物外外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂特定元素、前体和促进剂等。由于各种培养基的用用途途不不同同，其培养基的组组成成差差异异也很大。晤鲁长租父瑞腕芽麻寻仆壁麻萝恳挝群蕴特字作缺祷肖杀哟霓眉像涂屏距第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础22影响培养基质量的因素影响培养基质量的因素（1）原原材材料料质质量量的的影影响响培养基所用的原材料大多为复合材料，其中不少天然原料成分复杂，如玉玉米米浆浆、黄黄豆豆饼饼粉粉、花花生生饼饼粉粉、蛋蛋白白胨胨等往往因品种、产地、加工方法和贮藏条件的不同而造成内在质量较大的波动。（2）水水质质的的影影响响发酵工业所用的水有深深井井水水、地地表水、自来水和蒸馏水表水、自来水和蒸馏水等。深深井井水水的水质可因地质情况、水源深度、采水季节及环境不同而不同，地表水地表水的水质受环境污染环境污染的影响更大。颅雇置审戏焚因虏稚按戎助污损疫拜萨獭笨澈牛篮悯丽吭井疆蝉都炭碎碍第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2对于发酵工厂来说，恒恒定定的的水水源源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考考虑虑参参数数包包括括pH、溶溶解解氧氧、可可溶溶性性固固体体、污污染染程程度度以以及及矿矿物物质质组组成成和和含含量量。在抗生素发酵工业中，由于水质不同而导致这结果差异也时有发生时有发生。因此，有的国家为了避免水质变化对抗生素发酵产生影响，提提出出配配制制抗抗生生素素工工业业培培养养基基的的水水质质要要求求：浑浑浊浊度度20、色色级级25、pH6872、总总硬硬度度100230mgL（ppm）、铁铁离离子子0104mgL（ppm）、蒸馏残渣）、蒸馏残渣150mgL（ppm）。）。敢佐锻递惧寿躲皿搁戮俭继异宴社情盎铲晕亡夸馅盟吞蓄吊笺锌寡裁善百第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（3）灭菌操作）灭菌操作培养基必须经过灭菌方可使用，目前大多数生产用培养基均采用高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌法法，灭菌时，营营养养成成分分会受到一定程度的破坏。如葡葡萄萄糖糖在高温下易与氨氨基基酸酸和其他含含氨氨基基的的物物质质反应，对微生物有一定的毒性毒性。磷磷酸酸盐盐与与碳碳酸酸钙钙之间，磷磷酸酸盐盐、镁镁盐盐和和铵铵盐盐之之间间也也发发生生化化学学反反应应，生生成成沉沉淀淀或或络络合合物物，使可利用的磷酸根和铵离子的浓度大为降低。此外，蛋白质在高高温温下下变变性性，维维生生素素在在高高温温下下失失活活。因此，灭菌操作的不当不仅会减减少少培培养养基基中中有有效效的的营营养养成成分分，还会产生一些有有毒毒物物质质，给发酵带来不利的影响。掉求梢咒敝载翅灼材侦赦陆洛唐滥湖坛秘因谢仪益隙褂呸几碌质兰丽姓嫁第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（4）培养基黏度的影响）培养基黏度的影响培养基中一些不溶性的固体成分，如淀淀粉粉、黄黄豆豆饼饼粉粉等增加了培养基的黏度，直接影响微生物对溶溶解解氧的利用氧的利用，给产品的后提取也带来不便。在大规模发酵，对由于淀淀粉粉含含量量过过高高，不仅成本增加且使发发酵酵液液黏黏稠稠而而影影响响生生物物合合成成。如果营养成分缺乏，则可通过中间补料方法予以弥补中间补料方法予以弥补。工业生产中还可采用精精料料发发酵酵、基基础础原原料料液液体体化化（即用蛋白酶水解各种饼粉），或采取补补加加无无菌菌水水的方法，来降低培养基的黏度降低培养基的黏度，以提高发酵水平。祸吁概瞥妻盏墟亩貌溢尝盼袱氛瘤戮车馏搅籍唱隧荤柔喜累苏坪科什羹无第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（三）灭菌与除菌方法（三）灭菌与除菌方法1、灭菌方法、灭菌方法（1）加热灭菌）加热灭菌这是大规模装置中最最行行之之有有效效的的灭灭菌菌方方法法。影影响响这这种种方方法法有有效效程程度度的的因因素素主要有：待杀灭微微生生物物的的种种类类、待灭培培养养基基的的组组成成、pH以及培培养养基基中中颗颗粒粒成成分分的粒度。的粒度。一般说，生生物物的的营营养养体体在较较低低温温度度下下很快就可杀灭；而要杀杀死死微微生生物物的的孢孢子子，则需要至少121高高温温。在所有的微生物孢子中，嗜嗜热热脂脂肪肪芽芽孢孢杆杆菌菌的的孢孢子子对对热热的的耐耐受受性性最最强强，因此，人人们们常常常常用用它它作作为为检检验验灭灭菌菌是否彻底的指标。是否彻底的指标。汾促慧盈义数藉竿老魏灭捎拾涅十摘剑舌散堪还嘻载辙反武肝独自窄代娩第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2 常用的加加热热灭灭菌菌方方式式有高高温温蒸蒸汽汽湿湿热热灭灭菌菌法法和和干干热热灭灭菌菌法法。湿热灭菌比干热灭菌更为有效，因蒸汽在冷冷凝凝时时要释放大大量量的的潜潜能能，且蒸汽有强大的穿穿透透力力，易于传热易于传热。这种方法普遍被用来对培培养养基基和和设设备备容容器器进进行行灭灭菌菌。干干热热灭灭菌菌只适用于工业要求为灭灭菌菌后后能能保保持持干干燥燥状态的物料灭菌状态的物料灭菌。实验室规模的玻玻璃璃器器皿皿等等器器具具常采用干干热热灭灭菌菌。一一般干热灭菌的条件是般干热灭菌的条件是160，120min。显山秤哑蹿椎赤搔格吞镜域壹衰哺崩违堵州七灸融镍航拄院福咀疏领殃今第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（2）辐射灭菌）辐射灭菌辐辐射射灭灭菌菌即利用紫紫外外线线、高高能能量量的的电电磁磁波波或或粒粒子子辐射灭菌辐射灭菌，其中以紫外线最常用。紫外线对微生物有杀杀灭灭作作用用。其波波长长在在210313.2nm范围内有效，常用的有效波长为253.7nm。这与微生物体内核核酸酸的的吸吸收收光光谱谱相一致，DNA链上核核苷苷酸酸的的碱碱基基因因具有强烈的吸吸收收紫紫外外线线的能力而引起DNA结构的变化，如如DNA链链的的断断裂裂。DNA分分子子内内和和分分子子间间的的交交联联，嘧嘧啶啶二二聚聚体体的形成等，其中胸胸腺腺嘧嘧啶啶二聚体的形成二聚体的形成是紫外线改变DNA生物功能的重要途径重要途径。紫外线对芽芽孢孢和和营营养养细细胞胞都能起作用，但其穿穿透透力力极低极低，它对真菌孢子真菌孢子的杀灭能力不大。妻陇暮醋绩楚群绝迸巢介寸素顺哥炎辫瘪玫相侠汁章酌佬嗡水撵陪谨泅驹第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（3）介质过滤除菌）介质过滤除菌对培养液中某些不耐热的成分可采用过过滤滤除除菌菌法法，例如可用滤滤膜膜过滤装置、烧烧结结玻玻璃璃滤板过滤器、石石棉棉板板过滤器、素烧瓷素烧瓷过滤器以及硅藻土硅藻土过滤器等。发酵过程中所用的大量无无菌菌空空气气也也是是采采用用过过滤滤除除菌菌法法。传统的过滤方式是深层过滤，所采用的过滤介质有棉棉花花、玻玻璃璃纤纤维维、活活性性炭炭、石石棉棉滤滤板板和和活活性性炭炭纤纤维维素素等。深层过滤的除菌效果靠多种物理因素的共同作用来完成，这些因素主要包括沉沉降降作作用用、扩扩散散作作用用、惯惯性性撞撞击击作作用用、拦拦截截作作用用和和静静电电吸吸附附作作用用等。但它们存在着使用寿命短、更换作业麻烦的缺点。貉逐寡骂侨傀宵辛冉香茁吁狗奸因大秩尤凯遏兵液脱罢印己崔企去叁丰皱第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2又开发了一些新的过滤介质，如烧烧结结金金属属板板、烧烧结结金金属属管管、烧烧结结玻玻璃璃纤纤维维以以及及硝硝酸酸纤纤维维酯酯、聚聚砜砜、聚聚四四氟氟乙乙烯烯、尼尼龙龙微微孔孔滤滤膜膜等。这些过滤介质具有与深层过滤相同的过滤除菌效果，且使使用用寿寿命命较较长长，介质更换作业简便，因而使用起来要方便得多。从大气空间采采集集的的空空气气，在进过滤器之前，还要经过一系列复杂的处理过程，以尽量除去其中的粉粉尘尘、油和水油和水，从而确保进罐空气的洁净，如图25所示。家蹦称胀饿师嫩朵硅域骑尉摇辛暖寺赚值密挛诧创淄峻芋问楔段武抹秦政第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2附撑束关慌绣淘济熟赁扛启痔玛的犹蝇走利键刹登菏系慨岭到塞筒来盟脉第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（4）化学灭菌法）化学灭菌法化化学学灭灭菌菌法法是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋蛋白白质质变变性性等等作作用用而达到杀灭微生物的目的。常用的化学药剂包括乙乙醇醇、甲甲醛醛、苯苯扎扎溴溴铵铵（新新洁洁尔尔灭灭）、戊戊二二醛醛、环环氧氧乙乙烷烷、含含氯氯石石灰灰（漂漂白白粉粉）和和苯苯酚酚（石石炭炭酸酸）等。化化学学灭灭菌菌主要用来进行皮皮肤肤表表面面、器器具及无菌区域具及无菌区域的灭菌，不能用于培养基的灭菌。乙醇乙醇。乙醇具有杀菌作用，其杀菌能力随浓度不同而变化，浓度过高浓度过高，乙醇会使微生物细胞膜上微生物细胞膜上的蛋白质凝固，降低其渗透力蛋白质凝固，降低其渗透力，影响杀菌效果，浓度过浓度过低则杀菌力减弱低则杀菌力减弱。实验证明，以7075的乙醇杀的乙醇杀菌作用最强菌作用最强。常用于操作台面、皮肤及器具表面消毒表面消毒。牧沿袍轴猛俺疮纫朔魁知甲膜侄奴贸头曾遣赎锋监蝗邑契姆惩智惫承叔睹第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2 甲甲醛醛。可将甲甲醛醛溶溶液液（37）直直接接加加热热，按18mlm2计算用量，在12h内内产生的气气态态甲甲醛醛可杀灭所有营养细胞。还可用氧氧化化熏熏蒸蒸法法，即用高高锰锰酸酸钾钾（用量为甲甲醛醛的的一一半半）与甲醛混合，利用氧化反应产生的热量使甲醛挥发成气体进行杀菌。此法只适用于密密闭闭空空间间空空气气的的灭菌。灭菌。新新洁洁尔尔灭灭（苯苯扎扎溴溴铵铵）。按所购商品1：50稀稀释释后，可用于皮皮肤肤表表面面、操操作作台台面面及及有有关关器器具具消消毒毒。本品配制后的溶液可反复使用反复使用40次次。组买贯障瀑械陷花访瘦歉锤幌岳窗此曲宋铸襟郑宋舒膳筑技残五说擎县科第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2石石炭炭酸酸。石炭酸是一种常用的消毒剂，其渗渗透透力力很很强强，配配成成35的的水水溶溶液液，可用于接种室室内内喷喷雾雾，进行桌面、地面和墙壁的消毒桌面、地面和墙壁的消毒。气气体体灭灭菌菌法法。气体灭菌是使用气气体体化化学学试试剂剂对固型材料进行灭菌固型材料进行灭菌的方法。此方法适用于不不耐耐热热或或不不宜宜沾沾水水的的材材料料。用用作作灭灭菌菌剂剂的的气气体体（环环氧氧乙乙烷烷）是可可燃燃性性的的，毒毒性性很很强强，使用时要特别注意安全防护注意安全防护。昧深朱荡伴酥擒怯已惊杨卡符湘抠趁珊翱措涟耀唤汛鼎丧液富妻终绳芭腥第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础22培养基与发酵设备的灭菌方法培养基与发酵设备的灭菌方法工业生产上通常采用的蒸蒸汽汽灭灭菌菌法法，包括实实罐罐灭灭菌菌（实实消消）、空空罐罐灭灭菌菌（空空消消）、连连续续灭灭菌菌（连连消消）及附属设备灭菌附属设备灭菌。（1）实罐灭菌（实消）实罐灭菌（实消）实消是将配制好的培养基投入发酵罐中，同时开动搅拌器，通入高温蒸汽进行灭菌。实消的温度一般为121。灭菌时间则视培养基组成、罐容积而定，一般在3060min之间之间。在灭菌过程中，应让高温蒸高温蒸汽通过所有与发酵罐相连的管道、接口、阀门与电极汽通过所有与发酵罐相连的管道、接口、阀门与电极，以避免在这些部位留下死角而引起杂菌污染死角而引起杂菌污染。司战珊哩炒瑰浓裹绣蠢皖盗搪菊瞪段获裳吼谅入发憋呆歼坊晃损蹲呛泽辙第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2 实消又分直接加热和间接加热直接加热和间接加热两种形式。间接加热间接加热是使高温蒸汽通过发酵罐的夹层或内部夹层或内部蛇管蛇管，与培养基发生热交换；而直接加热直接加热则是使经纯化处理、不含杂质的高温蒸汽通入培养基中高温蒸汽通入培养基中，使其温度在短时间内升至要求的温度。在蒸汽与培养基直接接触时，有一部分蒸汽要冷一部分蒸汽要冷凝成水凝成水，从而使培养基稀释，因而在配制培养基时应预先扣除这部分冷凝水扣除这部分冷凝水。在实消过程中在实消过程中，通常同时使用直接加热和间接加直接加热和间接加热两种方式热两种方式，一般的做法是，用间接加热方式进行预热，使罐温升至罐温升至8090，然后同时采用直接加热和间接加热两种方式，使温度迅速升至使温度迅速升至121。辫玲洛帖荤贴尸俭雇雇贵胳蛾踞喊羚已旨咳磷侄紫午筏汇笔伤腊栖泥劲汰第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2实消过的培养基，要采用一定方式将其温温度度降降至至发发酵酵接接种种温温度度。这部分热量往往无法重复利用，因而，实消的能耗很高。值得注意的是，在高高温温杀杀菌菌的同时，可能会引起培养基成分的变化，尤其是维维生生素素等等耐耐热热性性差差的的物物质质尤为如此。糖糖类类与与氨氨基基酸酸等有有机机氮氮源源在高温灭菌时容易形成5羟羟基基糠糠醛醛和其他棕棕色色物物质质，对微生物的生长代谢有一定的毒副作用。另外，灭菌时磷磷酸酸盐盐和和碳碳酸酸盐盐之间相互作用，可形形成成不不溶溶于于水水的的磷磷酸酸钙钙，降低可可溶溶性性磷磷的含量。其pH也会发生较大幅度的变化，一般灭菌前后培养基pH变化在变化在0.20.5之间之间，有时也会超过超过1个个pH单位单位。见抄丁妙边模余鄙蔷涝怠辞挫烷澡跟鸟胳师雍钩傈张惑迁肠券准疫绷轰曰第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（2）空罐灭菌（空消）空罐灭菌（空消）空空罐罐灭灭菌菌即发发酵酵罐罐罐罐体体的的灭灭菌菌。空罐灭菌一般维持罐罐压压1.51052.0105Pa、罐罐温温125130、时时间间3045min。灭菌时要求总总蒸蒸汽汽压压力力不低于30105 3 5105Pa，使使 用用 压压 力力 不 低 于 2 5105 30105Pa。灭灭菌菌后后为为避避免免罐罐压压急急速速下下降降造造成成负负压压，要要等等到到经经过过连连续续灭灭菌菌的的无无菌菌培培养养基基输输入入罐罐内内后后，才才可可以以开冷却水冷却。开冷却水冷却。（3）连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）培养基通过连连续续灭灭菌菌装装置置、进进行行快快速速连连续续加加热热灭灭菌菌，并并快快速速冷冷却却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中，需要较较高高的的温温度度和和较较短短的的时时间间。其操作包括以下步骤：林茫露我廉鉴钱落鸟额睡侥姻筑庇把滑哪庸烂荚忍笑蹄方亚农燃脯对昏聂第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2淀赏泉压领默鹏彭阜箱特殖亩惰大痴卞饥婪唱弥皱俏卫橇饯株吩阉制乍墩第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2培培养养基基预预热热。将料液预预热热到到6075，避免连续灭菌时由于料料液液与与蒸蒸汽汽温温度度相相差差过过大大而产生水汽撞击声。连连续续灭灭菌菌。连续灭菌是在连消塔中完成的。连消塔的主要作用是使高温蒸汽与料液迅迅速速接接触触混混合合，并使料液温度很快升高到灭菌温度。连续灭菌的温度一般以126132为为宜宜，由于输送培养基的连连消消泵泵的出口压力一般为6105Pa，所以总蒸汽压力要求达到4510550105Pa以上。只有当两两者者压压力力接接近近，培培养养基基流流速速才才能能均均匀匀稳稳定定，否则流速非快即慢流速非快即慢，影响灭菌质量。贴岔朴傈垛巩确趣骂疯纽呛抨氟会肚狼拜砾韦彰雍扭肇仰袁悠边眷宏舅送第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2维维持持灭灭菌菌温温度度。由于连连消消塔塔加加热热时时间间较较短短，光靠这短时间的灭菌是不够的。因此，利用维持罐使料液在灭菌温度下保保持持57min，以达到灭菌的目的。维持罐的罐压一般维持在4105左右左右。冷冷却却生产上一般采用冷水喷淋冷却，即用冷水在排管外从上向下喷淋，使管内料液逐渐冷却。一般料液冷冷却却到到4050后，输送到预先空消过的罐内。在冷水喷淋前，冷却管内应充满填料。连连续续灭灭菌菌的时时间间短短、温温度度较较高高，培养基受到的破坏较少，故质质量量较较好好。连续灭菌时蒸蒸汽汽负负荷荷均均衡衡一一致致。但不足之处是所需设备较多。操作较麻烦，染染菌菌的的机机会相应增多。会相应增多。棚痛果梢悲寻肪脱炎茨韦泞苛毁塔宋饲豌讳爵慌插岂盲崇臻揪诵煎阳耍薛第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（4）发酵附属设备及管路的灭菌）发酵附属设备及管路的灭菌发发酵酵附附属属设设备备有总总空空气气过过滤滤器器、管管道道、计计量量罐罐、补料罐补料罐等。一般糖水罐灭菌时罐罐压压为为l105Pa、时时间间为为30min：油油罐罐（消消沫沫剂剂罐罐）灭灭菌菌的的蒸蒸汽汽压压力力为为1.51051.8105Pa、时间为、时间为60min。总总空空气气过过滤滤器器灭灭菌菌时，灭菌时的蒸汽压力为3.5105Pa左 右，总 过 滤 器 内 压 控 制 为 1.51052.0105Pa（表表压压），灭灭菌菌时时间间为为2h。灭菌完毕，自上端输入空气，自上而下吹干过滤介质自上而下吹干过滤介质。铝瞄牵腑傅衬朱烈曳霹馋的潭勒游父泞憾夸楼撵骗缚判唤笆啮子斧猜冗规第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2管管道道灭灭菌菌的蒸汽压力不不应应低低于于3.4105Pa（表表压压），灭灭菌菌时时间间为为1h。新安装的管道或长期未使用的管道灭菌时间可适当延延长长到到1.5h。灭菌后以无无菌菌空空气气保保压压，自然冷却自然冷却30min即可交付使用即可交付使用。梆漾诺诞贤拦浸杜缩贺妈洼扳昂瑟榴祁疵秘支扼剩面傅锗输哭还闯诊隔冕第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（四）微生物的培养方法（四）微生物的培养方法将微生物接种于培养基中，在特特定定的的条条件件下下增殖，此过程称为培养。特定条件一般是指温温度度、通通气气、pH和培养基组成和培养基组成。1培养装置培养装置（l）恒恒温温箱箱它是将微生物保持在一定温度进行培养的器具。可用于斜面和平板静置培养斜面和平板静置培养。（2）振振荡荡培培养养器器用于好气菌的液体培养。旋旋转转式式振振荡荡器器：三角烧瓶。往往复复式式振振荡荡器器：试管、三角烧瓶等。独臂振荡器独臂振荡器：L型管。舱桃屿元沾磷翠痘藐键零迈篷杭尸液葵左贬疆现喜糕蹬鞭旧埔毫踌注炮另第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（3）其其他他对于嫌嫌气气菌菌或或分分解解气气体体菌菌的培养，使用密密闭型或能够交换气体闭型或能够交换气体的容器。大大量量液液体体培培养养使用发发泡泡塔塔、发发酵酵桶桶、发发酵酵罐罐。特殊装置。景府偷闺帘夫约损舔孩紊恬誊逊炭劝迭薛谩深勒酌脚领串监救摈铝莲俊超第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础22培养方法培养方法（1）固体培养法）固体培养法斜斜面面培培养养。对于细细菌菌、酵酵母母，用接种针在斜面培养上划一条直线或全面涂抹；对于霉霉菌菌，则取一部分孢孢子子或或菌菌丝丝体体在斜面上划成弯弯曲曲钩钩状状，然后进行培养。平平板板培培养养。对于细细菌菌、酵酵母母，在平板培养基上适当涂抹，对于霉霉菌菌，接种时要将平板反过来，从下轻轻一点即可，然后再翻过来培养。穿穿刺刺培培养养。常用于嫌嫌气气菌菌（乳乳酸酸菌菌等等）的的保保藏藏或或明明胶胶的的液液化化试试验验等。它用接种针对深层培养基穿穿刺刺接种接种后培养，若是产生气体产生气体的菌会发生龟裂现象龟裂现象。疲旺论姐干却辆目袱凑傍秀增犬朴疗买薪释叫腺瞒叙铆勋粤右摧涪闭俺滇第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2其其他他固固体体培培养养法法。此类培养为用米米曲曲、马马铃铃薯薯和面包和面包进行的培养。（2）液体培养法）液体培养法静静止止培培养养法法。一般用于酵酵母母、嫌嫌气气性性细细菌菌、兼兼性性嫌嫌气气性性细细菌菌的培养以及各种生生理理试试验验等。对于霉霉菌菌也可在液体培养基中使用称作表面培养的静置培养法表面培养的静置培养法。振振荡荡培培养养法法。这是实验室最常使用的好好气气性性菌菌、兼性菌的液体培养法兼性菌的液体培养法。撞妥牡叔粟稳卖莹撂妓泉您伪齿岭觅妈折歹哨虏苫吾犊碟翟余掺岁锌担祸第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2为提提高高搅搅拌拌效效果果，增增加加通通气气量量，可在装装有有档档板板的烧瓶内培养，此时必须控制液量不不要要使使塞塞弄弄湿湿，因为塞沾湿后易污染杂菌，并同时降低通气效果。试试管管振振荡器荡器主要用于菌种筛选等大量菌株的处理。通通气气搅搅拌拌培培养养法法。在发泡塔、发酵桶、发酵罐等容器内的培养，均采用通气搅拌式的大规模培养通气搅拌式的大规模培养。窗帚趾忠雁吧露阀卒南束剃衰绽尘蒙枣顿吞抉字捅受撂如矫年共涟蚌杰裂第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2三、发酵过程的控制三、发酵过程的控制（一）发酵过程的（一）发酵过程的主要控制参数主要控制参数1、物理参数、物理参数（1）温温度度（）指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。（2）压压力力（Pa）这是发酵过程中发酵罐维维持持的的压压力力。罐内维维持持正正压压可以防止外界空气中的杂杂菌菌侵侵入入而避免污染，以保证纯种培养。棺陪沧接哭摩赣揣韧屠转原命吨绿穆洞诈村竣离醉翰遵铲简荧努势俯灵厨第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（3）搅搅拌拌转转速速（rmin）指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每lmin的转速来表示，它的大小与氧容量传递速率与发酵液的均匀性有关氧容量传递速率与发酵液的均匀性有关。（4）搅搅拌拌功功率率（kW）指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常常指指每每lm3发发酵酵液液所所有有消消耗耗均均功功率率（kW/m3）。它的大小与氧容量传递系数氧容量传递系数KLa有关。诞浴洽煮炽圆郸揖锥难掇陇祟零慕禽胎态狐讥灼喜妨字碰潮赫挝蓑艰歉娟第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（5）空空气气流流量量L（Lmin）空气流量是每1min内每单位体积发酵液通入空气的体积，也是需需氧氧发发酵酵的的控控制制参参数数。它的大小与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在一般控制在0.51.0L（Lmin）范围内）范围内。（6）黏黏度度（Pas）黏度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常以表表观观黏黏度度表示。它它的的大大小小可可改改变变氧氧传传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。递的阻力，又可表示相对菌体浓度。（7）浊浊度度（）浊浊度度能能及及时时反反应应单单细细胞胞生生长长状状况况的的参数参数，对某些产品的生产是极其重要的。（8）料液流量（）料液流量（Lmin）这是控制流体进料的参数。椿篓藉雹仗佩一牙扬顿盖刊欢疗试骆病馋阴红舀轨堡惹剥早查倾泳鞋卉灸第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础22、化学参数、化学参数（1）pH（酸酸碱碱度度）发酵液的pH是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。它是发酵工艺控制的重要参数之一。（2）基基质质浓浓度度（g100ml或或mg100ml）指发酵液中糖糖、氮氮、磷磷等重要营养物质的浓度。它的变化对产生菌的生生长长和和产产物物的的合合成成有重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。（3）溶解氧浓度）溶解氧浓度106（ppm）或饱和度（）或饱和度（）溶溶解解氧氧是需氧菌发酵的必备条件。利用溶溶氧氧浓浓度度的的变变化化，可了解产产生生菌菌对对氧氧利利用用的的规规律律，反映发酵的异常情况。祖黍给蛮敲同蹲捶趣窟蠕始缆罢抄姆舔懈剧珐琵躲碧啪氛母衡魏磁榴怎咽第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（4）氧氧化化还还原原电电位位（mV）培养基的氧化还原电位是影响微生物生长微生物生长及其生化活性生化活性的因素之一。（5）产产物物的的浓浓度度（gml或或Uml）这是发酵产物产产量量高高低低或或合合成成代代谢谢正正常常与与否否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。（6）废废气气中中的的氧氧浓浓度度（h）废气中氧含量与产生菌的摄氧率和摄氧率和KLa有关。（7）废废气气中中的的CO2浓浓度度（）测定废气中的CO2可以算出产生菌的呼呼吸吸熵熵，从而了解产产生生菌菌的的呼呼吸吸代代谢谢规律。规律。除上述外，还有跟踪细胞生物活性的其他参数，需要时可查有关资料查有关资料。严考悟玉鸭弟披蝴锈居晒祝丛谍祭盾靛以哺瓶溯利片摊滴倍沤胸拿返王蒲第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础23生物参数生物参数（1）菌菌丝丝形形态态丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡衡量量种种子子质质量量、区区分分发发酵酵阶阶段段、控控制制发发酵酵过过程程的的代代谢谢变变化化和和决定发酵周期决定发酵周期的依据之一。（2）菌菌体体浓浓度度菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一，特别是对抗生素次级代谢产物的发酵。在生产上，常根根据据菌菌体体浓浓度度来来决决定定适适合合补补料料量量和和供供氧氧量量，以保证生产达到预期的水平。根据发酵液的菌菌体体量量和和单单位位时时间间的菌浓、溶氧浓度、糖浓度、氮浓度和产物浓浓度度的的之之比比值值，这些参数也是控控制制产产生生菌菌代代谢谢、决决定定补补料料和和供供氧氧条条件件的的主主要要依依据据，多应用于发酵动力学的研究多应用于发酵动力学的研究。聪庙淬又单引尧慢瑶杨基答院扁怖汝初学甚比峭澄溜拖猿垮插覆枯灶食撵第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（二）发酵过程的变化规律与控制（二）发酵过程的变化规律与控制1、分批发酵、分批发酵分分批批培培养养是指在一封封闭闭培培养养系系统统内含有初始限制量的基质的发酵方法。（1）迟迟滞滞期期在接种后，这是一个不生长期。迟滞期的长短与3个因素有关个因素有关，一是新新的的培培养养基基组组成成及及培培养养条条件件与旧的越接近，则一般迟滞期越短；二是种种子子的的质质量量，一般移种对对数数生生长长期期的比移种其他生长期的细胞迟滞期短迟滞期短；三与接种量有关接种量有关，接种量大接种量大，迟滞期要相对短些。璃愈赌诀丈诡役卡庞像镇兔诉她状闻只蹦贞揭烟羡闷借侯画擂抑揭盒四斟第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（2）对对数数生生长长期期在这个分期中，细胞的生长率逐渐加大，达到最大生长率，此时将菌菌体体浓浓度度的自自然然对对数数与与时时间间作作图图可可得得一一直直线线。处于对数生长期的微生物其各种酶酶系系的的活活力力最最强强，因此工业生产中，常常以以此此作作为为种子种子移入新环境中以缩短发酵过程中的迟滞期。（3）减减速速期期和和稳稳定定期期在培养过程中，培养基中的营养物逐逐步步耗耗尽尽，微生物生生长长速速度度变变慢慢（进进入入减减速速期期），直直至至停停止止（进进入入稳稳定定期期）。由于这一时期菌体代谢十分活跃，有许多次次级级代代谢谢产产物物在在此此期期合合成成，因此也被称为生产期或分化期生产期或分化期。笋抑洽佃父拔倡踊谨捅折纸劳比念烟纽哲喷范艘园赡梅绳堕设笑诱但走号第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础22、补料分批发酵、补料分批发酵在发酵过程中采用补补料料分分批批培培养养技技术术的优越性如下。（1）可使底底物物的的残残留留浓浓度度保持在较低的水平，以免微生物受到这些底物的调节作用调节作用。（2）能够增加微生物细胞的合合成成能能力力。通过补料工艺能够不断地提供足够的养料提供足够的养料用于合成微生物细胞。（3）能够提提高高非非生生长长偶偶联联型型产产物物（如抗生素等次级代谢产物）的合成量。（4）可以解除快速利用底物而造成的阻遏效应解除快速利用底物而造成的阻遏效应。（5）能够降低发酵液的黏度，提高溶解氧的浓度降低发酵液的黏度，提高溶解氧的浓度。勒眨斗拓拖闷穗圣诅窝失嘘呼妄权过挥惟撂城棺碑磺京营党真土桶魏蔫综第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础23、连续发酵、连续发酵所所谓谓连连续续发发酵酵是指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的过程。连续发酵具有以下3个优点。（l）能维持较低的基质浓度较低的基质浓度，有利于产物形成产物形成。（2）可以提高设备利用率和单单位位时时间间的的产产量量，节省发酵罐的非生产时间非生产时间。（3）由于发酵罐内微微生生物物、基基质质、产产物物和和溶溶解解氧氧浓浓度等各种参数度等各种参数维持在一定水平，故便于自动化控制便于自动化控制。连续发酵由于长时间的连续培养难难以以保保证证纯纯种种培培养。且菌种发生变异养。且菌种发生变异的可能性较大。何窗弊妊堂酣边灭泡诚芝苍星胶遂晕桥与怀簿蜜轮罗姬束婉饰檀林拒沽绪第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础2（三）发酵过程的重要影响参数与控制（三）发酵过程的重要影响参数与控制1、温度的影响及与控制、温度的影响及与控制不同的微生物菌种的最最适适生生长长温温度度和和产产物物形形成成的的最最适适温温度度都是不同的。在发酵过程中，可用发酵热代表整个发酵过程中释放出来的净热量释放出来的净热量：Q发酵发酵Q生物生物Q搅拌搅拌Q蒸发蒸发Q湿湿Q辐射辐射最最适适发发酵酵温温度度随随菌菌种种、培培养养基基成成分分、培培养养条条件件和和菌菌体体生生长长阶阶段段而而改改变变，理论上，在整个发酵过程中不应只选一个培养温度，而应根根据据培培养养的的不不同同阶阶段段调调整整温温度，以达到最佳效果度，以达到最佳效果。玛幂镶瓶顷袄俏钞澈氰播蝎酸句讶钞险脆多稽咳后妹声玫披桅仪帜蜘斤冒第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础22、pH的影响与控制的影响与控制微生物生长都有最最适适pH范范围围及及其其变变化化的的上上下下限限，超出此上下限，菌体将无法忍受而自溶。pH对产物的合成也有明显的影响。合适的pH是是根根据据试试验验结结果果来确定的来确定的。在发酵过程中，首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，采用适适当当的的配配比比，使发酵过程中pH变化在合适的范围内。因因为为培培养养基基中中含含有有代代谢谢产产酸酸和和代代谢谢产产碱碱物物质质以以及及缓缓冲冲剂剂，它它们们在在发发酵酵过过程程中中要要影影响响pH的的变变化。化。如果达不到要求，就可在发酵过程中直直接接补补加加酸酸或或碱和补料的方式来控制。碱和补料的方式来控制。舔泞科智棕枯嚣删踩岗蝇挎提天檀捎诈囤掩譬巩赚舜散洼摈润回渺尖税碎第二章生物制药工艺技术基础2第二章生物制药工艺技术基础23、溶氧的影响与控制、溶氧的影响与控制溶氧是需氧发酵控制的最重要参数之一。氧在水中的溶解度很小、所以需要不断通通气气和和搅搅拌拌，才能满足溶氧的要求。溶氧高虽然有有利利于于菌菌体体生生长长和和产产物物合合成成，但溶氧太大有时反而会抑抑制制产产物物的的形形成成。因此需考查每种发酵的临界氧浓度临界氧浓度和最适氧浓度最适氧浓度。在在已已有有