生物催化法生产r-扁桃酸及其年产500吨规模的工厂工艺设计.doc

浙江工业大学硕士学位论文硕士学位论文论文题目：生物催化法生产R-扁桃酸及其年产500吨 规模的工厂工艺设计 作者姓名 沈祝飞 指导教师 郑裕国教授 薛亚平副教授 学科专业 生物工程 所在学院 生环学院 提交日期 2013年5月Biocatalytic synthesis of R-mandelic acid and process design of 500 t/a scaleSubmitted toZhejiang University of Technology for Master DegreeWritten byShen zhufeiMajoring in Biological EngineeringSupervised byProfessor Zheng YuguoCollege of Biological and Environmental Engineeringof Zhejiang University of TechnologyMay, 2013目 录摘 要IABSTRACTIII第一章 文献综述11.1 简介11.2 R-MA的工业合成方法21.3 生物催化法合成R-MA61.3.1 脂肪酶法生物催化合成R-MA61.3.2 氧化还原酶催化合成R-MA71.3.3 腈水解酶催化合成R-MA81.4 腈水解酶研究概况91.5 生物制药过程放大研究进展121.5.1 生物制药工艺设计121.5.2 生物工程优化与放大121.5.3 生物反应器设计141.6 本论文的研究目的与内容15第二章 生物催化法生产R-MA小试试验工艺研究162.1 发酵产酶工段工艺172.1.1 材料和方法172.1.1.1 菌株172.1.1.2 培养基172.1.1.3 菌种培养条件182.1.1.4 生物量测定182.1.1.5 腈水解酶活力测定192.1.2 诱导剂的选择192.1.3 发酵温度优化202.1.4 最优条件下5L发酵罐中培养212.1.5 pH连续调控对产酶的影响222.1.6 补加甘油对产酶的影响232.1.7 小结242.2 不对称水解工段工艺252.2.1 材料与方法252.2.1.1 酶催化剂252.2.1.2 静息细胞制备252.2.1.3 主要试剂252.2.1.4 腈水解酶活力测定252.2.1.5 HPLC分析方法262.2.1.6 薄层色谱层析(TLC)262.2.2 pH对腈水解酶活性的影响262.2.3 温度对酶活性的影响272.2.4 不同底物浓度对腈水解酶活性的影响292.2.5 金属离子对转化反应的影响302.2.6 助溶剂对催化反应的影响322.2.7 分批补料催化生产R-MA332.2.8 小结342.3 分离纯化工段工艺35第三章 生物催化法生产R-MA工艺放大研究383.1 产腈水解酶发酵罐放大工艺研究383.2 3L催化体系与100 mL体系反应结果比较413.3 小试工艺路线修正423.3.1 发酵液中催化反应的研究433.3.2 离子交换层析分离纯化R-MA433.4 本章小节44第四章 年产500t R-MA的工艺设计464.1 概论464.1.1 设计任务464.1.2 设计的技术依据464.1.3 设计原则464.1.4 工艺流程464.2 发酵工段工艺474.2.1 操作流程484.2.2 灭菌操作484.2.3 操作要点494.3 物料衡算494.3.1 生产规模494.3.1.1 生产批量494.3.1.2 各阶段产量494.3.1.3 种子罐公称体积504.3.1.4 罐参数汇总504.3.2 发酵罐进出物料衡算504.3.2.1 发酵培养基原料计算504.3.2.2 发酵罐进出物料514.3.2.3 发酵罐设计524.3.2.4 发酵罐物料平衡图544.3.2.5 发酵罐示意图564.3.3 不对称水解工段物料平衡564.3.4 离子交换树脂HZ 202计算574.3.5 制备R-MA总物料衡算574.4 能耗分析584.4.1 蒸汽耗量分析584.4.1.1 发酵空消与实消584.4.1.2 干燥工段584.4.1.3 蒸发结晶精提取工段594.4.2 冷却水耗量分析594.4.2.1 发酵工段594.4.2.2 双效浓缩器浓缩工段594.5 经济效益分析604.5.1 年经营费用计算604.5.1.1 折旧费和大修费604.5.1.2 原材料、燃料消耗费用604.5.2 利润、利润率、投资回收期计算614.5.2.1 利润614.5.2.2 利润率614.5.2.3 投资回收期614.5.3 生产盈亏平衡点614.6 车间布置614.6.1 车间区域和工艺设备布置原则614.6.2 工艺过程工序划分624.6.3 车间区域布置及其环境设计等级确定624.7 “三废” 处理62第五章 结语64参考文献65附录一：工艺流程图69附录二：发酵罐示意图70附录三：车间布置平面图71致 谢73浙江工业大学硕士学位论文生物催化法生产R-扁桃酸及其年产500吨规模的工厂工艺设计摘 要R-扁桃酸是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体，被广泛应用于制药与化工行业。生物催化法合成手性药物具有条件温和、催化效率高以及高度选择性等优点，并且无污染和能耗低，是一种环境友好型的绿色合成方法。腈水解酶作为生物催化法制备R-扁桃酸的一种重要工业酶，得到了广泛关注。本文以腈水解酶产生菌重组E.coli Q196S为研究对象，优化了重组腈水解酶的制备工艺，开发了pH连续调控工艺和甘油补加工艺，并在30 L发酵罐中经放大验证，产酶水平可提高至24991 U/L。研究了静息细胞不对称水解扁桃腈的转化条件，以及分批补料操作生产高浓度的R-扁桃酸，确定了最优催化工艺条件：菌体浓度50 g/L，加入1 mM的Ba2+和1%(v/v)异辛醇作为助溶剂，最适底物浓度64 mM，pH 7.5，反应温度45C。经过9.5 h的转化时间后，R-扁桃酸的积累浓度可达到587 mM，e.e.值99%。本文还进一步研究了反应混合液中R-扁桃酸的分离纯化工艺，在不影响e.e.值的前提下得到了高纯度的R-扁桃酸。在小试研究基础上，本文经过中试工艺优化及修正，确定了工艺放大法则采用体积溶氧系数KLa=常数，以及在分离纯化工段使用离子交换层析代替萃取操作。通过工艺流程设计、物料衡算、能量衡算、车间布置设计、“三废处理”及综合利用等内容的设计，完成了年产500吨纯度99%的R-扁桃酸工厂工艺设计。关键词 生物催化，腈水解酶，R-扁桃酸，工艺设计BIOCATALYTIC SYNTHESIS OF R-MANDELIC ACID AND PROCESS DESIGN OF 500 T/A SCALEABSTRACTR-mandelic acid is the important fine chemical intermediates and chiral prodrug with broad uses in pharmaceutical and chemical industry. Synthetizing chiral drug with biological catalysis method has many advantages, such as mild conditions, high efficiency and high stereoselectivity, etc. In addition, it is non-pollution and low energy consumption, which is an environment friendly green synthesis method. As nitrilases are important industrial enzymes that convert mandelonitrile directly into the R-mandelic acid, they receive extensive attention.This dissertation is devoted to the comprehensive understanding of the fermentation fundamental of nitrilase in the recombinant E.coli Q196S, optimizing the preparation technics of recombinant nitrilase and developing a novel technology of continuous regulating pH and glycerol fed-batch fermentation. Subseguently, the optimum process was verified in 30-L fermenter, and the production of nitrilase was 24991 U/L. The paper investigated the bioconversion conditions of mandelonitrile to R-mandelic acid with resting cells and preparation of R-mandelic acid at high accumulative concentration with fed-batch. The optimal catalysis conditions are as follows: 50 g/L resting cells, 1 mM Ba2+, 1%(v/v) isooctanol as co-solvent, substrate 64 mM, pH 7.5 and 45C. After continuous reaction for 9.5 h，acquired 587 mM R-mandelic acid and the e.e. value was 99%. Afterwards, the separation and purification of R-mandelic acid from the reaction mixture were studied.Based on lab experiment, the process conditions were investigated by magnified test and design of industrial production. After the process revised, KLa was the scale-up principle and extraction was replaced by ion exchange chromatography. To obtain process workshop of 500 tons R-mandelic acid per year, several contents, such as process design, material calculation, energy calculation, workshop layout design, “three wastes” treatment and comprehensive utilization were systematically investigated and designed.KEY WORDS: biocatalysis, nitrilase, R-mandelic acid, process design76第一章 文献综述1.1 简介单一构型手性药物已成为当前国内外新药开发和研究的关注重点，手性技术在新药研制中逐渐开始受到重视。手性药物在国内外上市销售的药物总数中所占比例正逐年上升，2005年全球范围内上市的新药已经有60%是单一构型药物1。据报道，手性药物2000年销售增长率超过13%，达到1330亿美元，2008年销售额已达2000亿美元2。自从欧洲爆发的“反应停”惨剧后，人们开始逐渐意识到消旋药物中的两个对映异构体在人体中的药理毒性、代谢过程以及药理活性都存在着极大的差异3。所以，美国食品及药物管理局FDA规定，使用消旋体申报的新药，需要提供关于消旋体和各对映异构体分别实施的毒理和药理实验报告，否则会被鉴定为药物中含有50%的杂质而不予批准，还规定包含手性分子药物必须以单一对映异构体形式申报。由于存在着巨大的利润还有市场需求，全球各大制药企业纷纷将工作重点投入到手性药物的研究开发，掀起了一阵手性药物开发的热潮。扁桃酸(mandelic acid，MA)又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或-羟基苯乙酸，两种对映异构体结构如图1-1。光学纯R-扁桃酸(R-MA)是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体4，广泛应用于多种光学活性药物的合成，如头孢菌素和半合成青霉素等抗生素5, 6、抗肿瘤药物7, 8、减肥药物9、农药10及其他药物11, 12。以R-邻氯扁桃酸为中间体的抗血小板聚集药物氯吡格雷居全球最畅销药品排行榜第二位13，对氯扁桃酸是新型卵菌纲病害杀菌剂双炔酰菌胺的原料物质14。R-MA还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，而且还能用于测定手性物质的绝对构型及光学纯度等等。R-MA被称为“万能”拆分剂15，其对醇胺类药物的拆分效果优秀16，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物，并且以R-MA为催化剂可将芳香族及脂肪族醛均不对称转化成为相应手性醇17, 18。图1-1 S-扁桃酸和R-扁桃酸结构式科学家们正在不断开发R-MA的新用途，R-MA的市场需求与此同时也在日益扩大。据统计，国际上已有部分公司有能力合成光学纯MA19，主要公司有日东化学公司、日本山川药品公司以及德国瓦克公司等，但仍然不能满足市场需求。目前，国内也已经有部分企业能够生产光学纯的扁桃酸，但还没有出现规模化生产单一构型的报道。因此，加大力度对单一构型扁桃酸的研究开发，打破国外企业对手性R-MA的市场垄断，并寻找出适合我国的工业化生产方法意义重大。与此同时，研究出新的生产工艺用于R-MA和其他手性药物的工业生产，不仅对满足我国光学活性药物产品市场的需要具有实际意义，而且对解决手性技术领域所存在的多种问题也具有重大的理论指导意义。1.2 R-MA的工业合成方法最早产生也是国内目前仍在采用的R-MA合成方法是先合成外消旋的 MA，然后通过不对称拆分方法得到光学活性的R-MA。外消旋MA的主要合成路线有三种20，分别是(1) 以苯甲醛为原料：(2) 以苯为原料：(3) 以苯乙酮为原料：其中，以苯法合成外消旋MA水污染严重，三废量大，而且成本较高；以苯甲醛为原料合成MA使用剧毒物氰化钠，而且工艺路线长，投资费用高；以苯乙酮为原料合成MA三废排放量小，工艺路线短，投资省，生产容易控制，其工艺流程图如图1-2。图1-2 以苯乙酮为原料合成MA的工艺流程图21外消旋MA的主要拆分方法有非对映体盐结晶拆分法、色谱拆分法、萃取拆分法、电泳拆分法和酶催化拆分法。目前工业上应用最广泛的拆分技术还是非对映体盐结晶拆分法。使用盐结晶法拆分消旋MA的拆分剂主要包括生物碱(辛可宁、吗啡、麻黄碱、士的宁)、手性胺(L-苯乙胺、2-氨基-1-丁醇等)、氨基酸及其衍生物等。其中生物碱和2-氨基-1-丁醇拆分效果较好，R-MA收率可以达到75%85%22, 23。在20世纪70年代时，美国Cyanamid公司就开始使用(-)-2-胺基-1-丁醇对消旋MA进行拆分，并且对副产物进行了消旋，效果良好24。另外，美国Kay Fries公司开发了D-苯甘氨酸丁酯及其盐酸盐作为拆分试剂，对消旋MA进行拆分的技术，但是只得到了一种MA的对映异构体25。在此基础上，臧健等人同样使用D-苯甘氨酸丁酯及其盐酸盐作为拆分剂，在水反应体系中制得R-MA收率98.9%，光学纯度32%；S-MA收率90.1%，光学纯度66.7%26, 27。L-丙氨酸和L-苯乙胺是当前工业生产手性MA的主要拆分剂，采用L-丙氨酸拆分一次，重结晶两次可获得R-MA收率98%以上28；以L-苯乙胺为拆分剂，重结晶两次后R-MA总收率29.6%，光学纯度99.5%。后来，Eeloc等人通过比较二元相图，发现(S)-甲基苯乙胺更加适合作为MA的拆分剂29。色谱拆分法也是较常用的MA手性拆分方法，所使用的色谱体系以HPLC为主。环糊精(-CD)是色谱法所使用的主要手性拆分剂，后来经过各种修饰-CD作为固定相的拆分效果有了较大改进。阮源萍等人采用自制的2,6-二-O-戊基-环糊精涂渍Symmetry C8色谱柱，以反相HPLC模式研究了消旋MA的色谱拆分，分离条件也得到了优化30。研究结果表明，采用优化后的0.5%三乙胺-甲醇-乙酸缓冲液或者水-甲醇流动相，MA的对映异构体能够达到甚至接近基线分离。色谱拆分法的拆分纯度最高，具有良好的稳定性、选择性以及容量，但是这种方法消耗和设备费用都太大，成本高，不适合工业规模化生产。近几年，Kaspereit等人提出了模拟流动床色谱(SMB)概念，节约了投资和操作成本31。SMB打破单一色谱柱分批处理方式，形成连续处理，极大程度地提高了生产力。Malte等人进一步采用SMB和选择性结晶相混合的方法，对消旋MA进行拆分，放弃了原本仅有一个操作单元的拆分体系，形成了更多的单元，从而达到降低成本，提高效率的目的32。手性萃取拆分法是近几年才提出的手性分离方法，具有相当大的潜力，该方法的基本原理是：依靠两种对映异构体与手性选择体生成两种非对映异构体的自由能差，从而将外消旋体分离，若是在足够多的级数下，可实现对映异构体的高纯度分离。唐课文等人研究了以疏水性L-酒石酸酯作为手性选择体，R-MA和S-MA在水-有机溶剂两相体系，以及以N-n-十二烷基-L-羟基脯氨酸作为手性选择体，在含有N-n-十二烷基-L-羟基脯氨酸手性配体(Li)和Cu2+两相体系中的分配行为33, 34。色谱拆分法虽然潜力很大，但是因为是新方法，所以技术上并不成熟，有待进一步完善与发展。毛细管电泳(CE)是一种电迁移技术，由于具有经济、快速、高效等特点，广泛应用于各种药物对映体的分离。扁桃酸的毛细管电泳拆分,主要有亲和毛细管电泳(AZE)、毛细管电色谱(CEC)和毛细管区带电泳(CZE)3种。CE的原理是加入手性选择剂与对映体分别结合，根据选择剂和对映体结合的稳定常数差异进行分离。邱彬等人以羟丙基-CD作为手性选择体，Tris-H3PO4为缓冲溶液，用CE法拆分消旋MA，得到R-MA平均回收率97.8%，分离度1.59；S-MA平均回收率101.5%，分离度为1.6835。毛细管电色谱(CEC)是HPLC和CE相结合的新型液相色谱分离技术，它继承了HPLC的高选择性和毛细管电泳的高效率，同时还能有效分离毛细管电泳法不能分离的某些物质。能够应用于CEC法的手性选择剂有很多，其中最好的一种是糖肽类抗生素(GAs)。Salvatore等人把大环抗生素MDL 63,246(Hepta-Tyr)作为手性固定相，采用反相HPLC的CEC法成功对消旋MA进行了拆分36。酶催化拆分法属于动力学拆分方法，该方法的原理是利用酶对特定光学异构体的专一性，催化某一对映异构体优先反应，再利用物理化学性质差异实现对映异构体的分离。Ganapati等人在非水介质中，以脂肪酶为催化剂，对MA的对映体进行手性分离，认为Candida的脂肪酶novozym 435作为催化剂具有良好的效果，R-MA的光学纯度78%，转化率19%37。近几年，许多新技术被用于改进酶催化拆分方法。微生物表面展示技术应用于外消旋有机酸的拆分，将Pseudomonas fluorescens脂肪酶展示于Escherichia coli细胞表面，制作的整细胞生物催化剂，在拆分消旋MA时具有更好的活性和选择性，并在120 h重复10次实验均能保持活性38。通过可控制的固定相和介质工程技术，可以调整脂肪酶的对映异构体选择性39。Eiji等人混合了Pseudomonas降解S-MA制备R-MA体系，以及用Micrococcus Propionibacterium freudenreichii催化苯甲酰甲酸不对称转化为R-MA体系，优化了拆分过程，R-MA的最终收率达到60%，化学纯度90.0%、光学纯度99.0%40。酶催化拆分法立体选择性强，反应条件温和，污染少，但是如何提取出活性单一的对映异构体，选育高效、专一的微生物菌种，提高酶自身稳定性，都是目前亟待解决的问题。宋航等41人发明了一种R-MA工业化连续制备方法。采用光学纯的D-苯甘氨酸正丁酯(拆分剂)与外消旋MA反应生成两种非对映异构体的盐，然后利用两对非对映异构体盐在拆分剂和重结晶溶剂中的溶解度差异将它们分离，再通过重结晶操作将非对映体盐提纯，通过酸化、萃取、蒸发得到R-MA，将拆分后的过滤液蒸干用水溶解，酸化、萃取、蒸发得到S-MA；再将重结晶液浓缩，加入一定量的外消旋MA于浓缩液中进行拆分，水相中的拆分剂通过加入碱液回收，实现了拆分剂的回收利用。再将光学纯度在60%70%的S-MA通过L-苯甘氨酸正丁酯进行拆分，并依照类似方法实现S-MA的拆分和拆分剂的回收利用，最终获得的R-MA和S-MA光学纯度均在99%以上。1.3 生物催化法合成R-MA由于生物酶对底物有高度的立体选择性，不仅包括化学选择性和非对映异构体选择性，还具有严格的区域选择性和对映异构体选择性，可直接将化学合成的外消旋衍生物、潜手性化合物或前体转化成单一对映异构体的光学活性产物。生物催化的手性反应还具有效率高、反应条件温和、反应步骤少、产品光学纯度高等优点，并且生物催化过程能耗低、无毒、无污染，符合21世纪“绿色化学”的要求，被认为是手性药物生产取得突破的关键技术。总结国内外文献报道，主要通过3种酶催化反应合成R-MA：利用脂肪酶分解扁桃酸甲(乙)酯制备R-MA；利用氧化还原酶体系催化制备R-MA；依赖于腈水解酶，以外消旋的扁桃腈为底物，制备光学纯R-MA。1.3.1 脂肪酶法生物催化合成R-MA脂肪酶法以消旋扁桃酸甲(乙)酯为底物，利用脂肪酶优先反应生成R-MA这一特点，以控制在反应初期生产具有较高对映过量值(e.e.值)的R-MA，反应过程如图1-3。图1-3 扁桃酸乙酯转化生成R-MA42Yadav等对脂肪酶在非水相介质中催化水解外消旋扁桃酸甲酯制备R-MA进行了研究。用离子交换树脂IRA 400作为催化剂通过酯化作用将外消旋的MA与甲醇混合制备外消旋扁桃酸甲酯，再分离得到R-MA。用Novozym 435脂肪酶特异性水解24h后，光学纯度达78%，转化率19%37。高静等在非水体系中对脂肪酶催化水解扁桃酸乙酯外消旋混合物拆分R-MA进行了初步研究。筛选出脂肪酶N435作为催化剂，叔丁醇作为溶剂，R-扁桃酸乙酯的转化率41.6%，e.e.值84%43。随后王垚等对脂肪酶在离子液体中不对称水解扁桃酸乙酯制备R-MA进行了研究，发现脂肪酶Novozym 435在离子液体BMMBr中的活性和立体选择性最高。与在叔丁醇介质中拆分相比，e.e.值有所降低但产率大幅上升，并且反应时间缩短了1/4，由于离子液体的循环使用，这种方法更加符合可持续发展的战略目标44。在最适条件下反应6 h，产物R-MA的e.e.值可达58.78%，产率65.23%。脂肪酶在对外消旋底物进行对映体选择性水解的时候，未参加反应的对映体往往会保留，必须对其进行消旋化作用，这样才能从根本上提高单一异构体的e.e.值。1.3.2 氧化还原酶催化合成R-MA苯乙酮酸已成为一种廉价、广泛使用的化工原料，对其直接进行不对称还原，制备高光学纯度的R-MA，将减少一步酶促反应45。李忠琴等以苯乙酮酸为底物，筛选出的酵母菌突变株S.c1-MA16为催化剂，合成的R-MA收率达99%，e.e.值99.8%46。黄亚燕等考察了酵母菌株FD11b，不对称还原苯乙酮酸，生产R-MA的重复使用性能。在持续6批次的还原反应中，一直保持着较高的催化活性，并且e.e.值均高于96.5%。最优条件下30 L发酵罐，进行分批放大实验，反应时间49 h，产物R-MA收率达96.1%，e.e.值98.5%47。随着游离细胞转化苯乙酮酸制备R-MA的深入研究，也由于固定化细胞有利于操作，储藏稳定性好等优越性，研究者开始使用固定化酵母细胞，为了增加菌体的稳定性和利用率。Li等研究了壳聚糖包埋啤酒酵母将苯乙酮酸生物不对称还原为R-MA，并研究了固定化条件及特性48。Xiao等研究了使用海藻酸钠固定化Saccharomyces cerevisiae FD11b，生物转化苯乙酮酸制备R-MA的动力学特征，建立了有关还原动力学和内扩散的数学模型，分析胞内传递传质的影响49。建立动力学模型能更好的分析固定化细胞转化，并对其提供理论依据。1.3.3 腈水解酶催化合成R-MA腈水解酶是一类可以将腈转化成相应酸的酶，当以扁桃腈为底物时，腈水解酶不对称水解成R-MA，并且它的理论动力学反应产物收率是100%，本设计采用的就是腈水解酶法生物催化合成R-MA。国内许建和团队以乙腈为唯一氮源，从土壤中筛选获得了一株腈水解酶菌株，并命名为ECU0401。研究发现ECU0401所产生的腈水解酶能有效地催化消旋扁桃腈不对称水解为R-MA，其最适pH 6.5，反应温度30C，经过12 h的催化反应，R-MA的收率为41.5%，e.e.值超过99.9%50。Pathak等还发现大麦、卷心菜、萝卜等多种植物中富含腈水解酶，这大大扩展了腈水解酶的来源。提高腈水解酶稳定性，并对其进行回收利用，可以极大地降低生产成本。Kaul等发现海藻酸盐固定化细胞效果最好，静息细胞只能重复利用9次，而海藻酸盐固定化后的细胞可反复利用35次，仍具有88%的转化活性，e.e.值保持97%51。近年来快速发展起来的遗传学和基因工程也为进一步高效利用腈水解酶提供了可行性条件和理论基础。DeSantis等建立了一个腈水解酶库，首先从腈水解酶库中筛选得到有效水解扁桃腈合成R-MA的对象，然后对其中产量较高的腈水解酶进行深入研究，催化反应3 h后产率86%，e.e.值98%。Rey等则对由Alcaligenes faecalis ATCC 8750中提取到的腈水解酶进行基因修饰和固定化发现，该固定化腈水解酶能高效选择性水解消旋扁桃腈生成R-MA，pH 8.5时收率和e.e.值均可高达99%52。因此，结合固定化和基因重组技术制备R-MA应用前景广阔。Banerjee等将P.putida中的腈水解酶基因克隆至pET 21b(+)，并作为组氨酸标记蛋白在E.coli中过量表达。通过IPTG诱导E.coli BL21细胞，从粗细胞提取物中纯化得到组氨酸标记蛋白。具有高腈水解酶活性的重组E.coli被用于不对称水解外消旋扁桃腈合成R-MA。由于催化反应过程中扁桃腈会自发降解为HCN和苯甲醛，伴随着R-MA和NH3的生成，反应液中的扁桃腈浓度不断降低。反应结束后，单位体积产量(单位体积反应液每小时生成的R-MA质量)为1.14 g/L/h，催化产量(每克催化剂生成R-MA的质量)为1.36 g/g，与原始菌株相比均有较大提高。本实验室从土壤中筛选出了一株产腈水解酶菌种，经过诱变育种技术，得到遗传稳定的高活性菌株Alcaligenes faecalis ZJUTB10，成功开发了腈水解酶生物催化制备R-MA的工艺，并已在企业完成了生产中试阶段。目前，腈水解酶作为生物催化剂不对称水解扁桃腈制备R-MA的工艺过程如图1-4。图1-4 腈水解酶催化生产R-MA工艺过程1.4 腈水解酶研究概况腈水解酶最早是由Thman和Mahadevan于1964年从大麦叶中分离出来，能够将吲哚乙腈水解成为吲哚乙酸，所以将该酶命名为吲哚乙腈水解酶。但是在往后的研究中发现，这种纯酶对26种不同的腈化合物均具有活性，它的最适水解底物不是吲哚乙腈，而是3-氰基吡啶，水解3-氰基吡啶的酶活是吲哚乙腈的8倍。因此，Thman和Mahadevan将其命名为腈水解酶(Nitrilase,EC 3.5.5.1)。近年来有学者在拟南芥 ( A.thaliana ) 中分离出四种腈水解酶，包括有NIT1、NIT2、NIT3、NIT4。前三种腈水解酶能将3-吲哚乙腈转化成3-吲哚乙酸，而NIT4只对-氰基-L-丙氨酸有催化能力53。根据底物特异性，腈水解酶普遍被分成三大类：(1)芳香类腈水解酶，主要水解芳香腈，如某些真菌酶和Rhodococcus rhodochrous J1；(2)脂肪类腈水解酶，主要水解脂肪族的氰基，如Acidovorax faecalis 72W和R.rhodohrous K22菌株产生的腈水解酶；(3)芳基乙腈水解酶，主要水解芳基乙腈类物质。表1-1显示的是来自于不同微生物的腈水解酶性质比较。表1-1 不同微生物腈水解酶比较SourceMolecular mass (kDa)Optimal pHOptimal temperature (C)ReferenceAlcaligenes faecalis ATCC87504607.5404554Alcaligenes faecalis JM32757.54555Aspergillus niger K106508.04556Alcaligenes sp. ECU04013768.0404557Bradyrhizobium japonicum USDA1103407.08.04558Fusarium solani O15808.0404559Pseudomonas uorescens Pf-51387.04560Pseudomonas putida4127.04051根据氨基酸的同源性，腈水解酶属于蛋白超家族，同时也称为腈水解酶超家族。腈水解酶超家族中的酶都含有一个特定的空间结构，蛋白结构单元由一个-的三明治结构组成53。腈水解酶的这种结构已经通过X-ray衍射技术得到确认，并且其空间结构也通过与超家族内其他成员的同源性比较而推导出61。腈水解酶的反应机理如图 1-5所示，腈水解酶的半胱氨酸残基上的巯基具有很强的亲核性，使整个过程类似于一般化学反应中碱催化下的氰基水解62。腈水解酶的活性部位不含有金属离子，绝大多数金属离子及金属离子螯合剂，比如EDTA、重氮基和氰基等对酶活力都没有明显抑制作用，但是能与巯基反应的金属离子，如Ag+和Hg+等却对腈水解酶有较强的抑制作用。由此可知，腈水解酶半胱氨酸上的巯基在催化水解反应过程中起着关键性作用。Brenner等将腈水解酶超家族分为13个分支，并发现在果蝇及蠕虫中的组氨酸三联体(Fhit)，和腈水解酶(Nit)形成融合蛋白共同编码63。实验检测8只小鼠，其中有7只的Nit和Fhit mRNA积聚水平相同，由此推测Fhit的接头分子可能是Nit。根据蠕虫Nit Fhit晶体结构分析，其活性部位含有Glu-Lys-Cys残基，Brenner等人推测整个腈水解酶大家族的催化活力是由Glu-Lys-Cys催化单元主导，Glu-Lys-Cys三联体残基的结构如图1-662, 64。腈水解酶反应的高效性还有温和性，使得其具有重要的工业应用价值，而且在工业生产上应用成功的例子已有较多报道。例如，Lonza公司筛选出新的菌株用于5-羟基-吡嗪-2-甲酸及5-羟基-吡啶-2-甲酸的生产，利用烟酸羟基化酶和腈水解酶的协同作用，转化率接近100%，明显优于传统化学法。杜邦公司利用Acidovorax facilis 72W腈水解酶，开发了催化2-甲基戊二腈制备1,5-二甲基-2-哌啶酮的工业化生产过程。图1-5 腈水解酶催化反应机理62图1-6 腈水解酶超家族三联体结构621.5 生物制药过程放大研究进展1.5.1 生物制药工艺设计生物药物是世界各国医药产业重点发展的方向，生物制药在制药行业中占据着重要地位。生物制药工厂工艺设计是生物制药企业基本建设的关键一步，必将发挥越来越重要的作用。生物制药工厂工艺设计，不仅要具有一般制药工厂工艺设计知识，如生产工艺流程设计、工艺设备布置设计、管道设计以及制药过程原料和设备、药物制剂生产工艺、药品生产质量管理规范、化学工程、药物分离与纯化技术等，而且还要具有生物制药工厂工艺设计的专门知识65。生物制药工厂工艺设计是一门综合应用型学科，在具体进行生物制药工厂工艺设计时必须遵循相关国家规范、规定和标准，做到技术上先进，经济上合理。生物制药工厂工艺设计的要求有：(1) 随着科学技术的发展，生物制药工厂已逐步实现现代化生产，在产品结构、工艺技术、生产装置、基础理论研究等方面都有较大突破。因此，在进行生物制药工厂工艺设计时，应反映科学技术的进步，采用先进的工艺技术和装置。(2) 设计工作必须认真进行调查研究，加强技术经济的分析工作，设计的技术经济指标以达到或超过国内同类型工厂生产实际平均先进水平为宜。(3) 生物制药工厂工艺设计是系统工程，涉及相关的规范、规定等，在应用时，要给予正确的体现。尤其是要遵循可持续发展的原则，严格执行药品生产质量管理规范和标准工艺操作规程来指导设计。(4) 生物制药工厂工艺设计要求设计人员应具备一定的工程实践经验和理论知识，要经常深入生产现场