DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能.pdf
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1、第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报(医学科学版)JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能邓家成,彭丽妹,石颖鹏,钟小敏(中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心,广东 广州 510080)摘要:【目的】探讨 DANCR 在人胚胎干细胞(hESC)向内胚层(DE)分化中的作用。【方法】建立体外诱导hESC向DE分化的体系,检测DANCR的表达水平与DE分化的相关性;利用慢病毒体系敲低hESC的DANCR表达水平,将敲低DANCR
2、的hESC进行DE分化;用qPCR和Western blot方法检测DE分子标志物SOX17和FOXA2,以及原条分子标志物Brachyury(T),EOMES,MIXL1和GSC的表达水平;用Dual luciferase reporter assay和qPCR证明在DE分化过程中DANCR与WNT通路的相互作用。【结果】体外诱导hESC向DE分化的体系能够有效模拟体内DE分化,DANCR的表达水平随DE分化进程逐渐下降。建立敲低DANCR的hESC细胞株,DANCR表达水平相比对照组显著降低(P 0.001)。干扰DANCR表达使分化早期的原条分子标志物Brachyury(T),EOMES
3、,MIXL1和GSC,以及分化后期的DE分子标志物 SOX17和FOXA2 的mRNA表达水平相比对照组显著降低(全部P 0.05)。并且,在DE分化过程中,敲低DANCR组的WNT通路的转录活性相比对照组显著降低(P 0.05),表现为WNT通路下游基因FZD5,FZD8,SFRP1,FRZB和ANKRD6 mRNA表达水平明显减少(P 0.05)。人为激活细胞内-CATENIN蛋白活性,能够有效回补由于敲低DANCR导致的DE分化缺陷。【结论】DANCR在DE分化过程中逐渐下调并促进DE分化发生,DANCR可能通过与WNT通路相互作用参与调控hESC向DE分化。关键词:内胚层;分化;长链非
4、编码RNA;DANCR;WNT信号通路中图分类号:R34 文献标志码:A 文章编号:1672-3554(2024)01-0045-09DOI:10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20240004.007DANCR Regulates hESC Differentiation Towards Definitive EndodermDENG Jiacheng,PENG Limei,SHI Yingpeng,ZHONG Xiaomin(Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering,Zhongshan
5、 School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)Correspondence to:ZHONG Xiaomin;E-mail:Abstract:【Objective】To explore the function of DANCR during the differentiation of human embryonic stem cells(hESC)toward definitive endoderm(DE).【Methods】The in vitro DE differentiation system w
6、as established and its efficiency was verified.The correlation between the expression level of DANCR and DE differentiation process was detected.Using lentivirus system,we stably knocked down DANCR in hESC.The shDANCR hESC line was applied to DE differentiation,using qPCR and Western blot to detect
7、the expression of DE marker genes SOX17 and FOXA2,and that of primitive streak marker genes Brachyury(T),EOMES,MIXL1 and GSC.Dual luciferase reporter assay and qPCR were used to confirm the interaction between DANCR and the WNT pathway during DE differentiation.【Results】The in vitro differentiation
8、system mimicked DE differentiation efficiently.And the expression of DANCR was gradually downregulated during differ 基础研究 收稿日期:2023-09-06 录用日期:2023-10-18基金项目:科技部国家重点研发计划(2017YFA0105501);广州市科技计划项目(202102080397)。作者简介:邓家成,第一作者,研究方向:干细胞与再生医学,E-mail:;钟小敏,通信作者,副教授,博士生导师,E-mail:第45卷中山大学学报(医学科学版)entiation.D
9、ANCR was efficiently knocked down in the shDANCR hESC line(P 0.001).Compared with those in the control group,the expression levels of primitive markers Brachyury(T),EOMES,MIXL1 and GSC,as well as DE markers SOX17 and FOXA2,were significantly decreased in shDANCR groups(P 0.05).Furthermore,the transc
10、riptional activity of the WNT pathway in shDANCR groups was lower than that in the control group(P 0.05).And RNA levels of downstream genes of the WNT pathway,FZD5,FZD8,SFRP1,FRZB and ANKRD6,were significantly decreased in shDANCR groups(P 0.05).Forced activation of-CATENIN rescued DANCR knock down-
11、induced deficiency in DE differentiation.【Conclusions】The expression of DANCR decreases during DE differentiation.DANCR may promote DE differentiation through modulating the activity of the WNT pathway.Key words:definitive endoderm;differentiation;long non-coding RNA;DANCR;the WNT pathwayJ SUN Yatse
12、n Univ(Med Sci),2024,45(1):45-53内胚层(definitive endoderm,DE)是胚胎发育过程中由多能性细胞分化而来的三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)之一,它起始形成于原肠胚阶段1。DE可以进一步发育产生人体的很多组织器官,例如肝脏、胰脏和小肠等。DE的分化潜能使其有望成为细胞替代治疗中的重要细胞来源。因此,对调控DE分化的分子机制的深入研究有助于促进其在再生医学方面的应用。已有文献报道2-3,转化生长因子(transforming growth factor-,TGF)信号通路和WNT信号通路在DE分化过程中发挥重要作用。原条(primitive st
13、reak,PS)是中胚层和内胚层的共同祖细胞,在原肠胚阶段,WNT信号通路和 TGF 信号通路共同刺激 PS 相关基因【如 B(T)(brachyury)和 EOMES(eomesodermin)】的 表达,从而促进多能干细胞分化为PS4。随后,TGF信号通路能够促进DE分子标志物【如性别决定区Y 盒转录因子 17(sex determining region on Y-box transcription factor 17,SOX17)和叉头框蛋白 A2(forkhead box A2,FOXA2)】的表达,诱导 PS 进一步分化为 DE5。在 WNT、骨形态发生蛋白(bone morpho
14、genetic protein,BMP)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)信号的诱导下,DE可继续分化为前肠和中后肠,产生肝脏、胰腺和胃肠道等。基于上述研究结果,有文献报道通过同时激活WNT信号通路和TGF信号通路,能够在体外诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)分化为DE细胞6。利用这种体外分化体系,很多工作对DE分化的分子机制进行了广泛研究,例如-连环蛋白(-CATENIN)、SMAD2/3、八聚体结合转录因子 4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4
15、)和NANOG等蛋白质可以通过分子间相互作用,控制WNT信号通路和TGF信号通路活性,从而对DE分化进行调控4,7。但是,对于长链非 编 码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在hESC向DE分化过程中的作用,目前研究还相对较少。lncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的内源性RNA分子,大多数没有蛋白质编码能力,在细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生和免疫调节中发挥广泛的作用8-9。lncRNA 分化拮抗非蛋白编码 RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA,DANCR)已被报道可参与多种生理过程,如干
16、细胞维持、肿瘤耐药、癌细胞生长、转移和凋亡等10-16。尽管对DANCR在肿瘤生物学中的作用已有广泛的研究,但DANCR对hESC分化的调控功能却鲜有报道。在本研究中,我们发现DANCR在未分化的 hESC 中表达量非常丰富。虽然对于维持hESC的多能性不是必需的,但是DANCR参与了调节 hESC 向 DE 分化的过程。敲低 DANCR 能够降低WNT信号通路活性,进而阻碍DE分化。此外,直接激活细胞内的-CATENIN能回补敲低DANCR 导致的 DE 分化缺陷。综上所述,本研究发现DANCR和 WNT信号通路之间的相互作用可影响DE分化的效率,DANCR可能成为调控hESC向DE分化的新
17、型分子靶点。46第1期邓家成,等.DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能1 材料与方法1.1细胞株、质粒人胚胎干细胞系H9细胞:购自ATCC公司;人胚肾上皮 293FT 细胞:Invitrogen 公司。pMDG、pRSV 和pMDLg/pRRE:Addgene 公司;慢病毒干扰对照质粒 IMIRXPress:SBI 公司;慢病毒干扰质粒shDANCR#1和shDANCR#2:由前期已发表工作构建;TOP-Flash、FOP-Flash、pRL-TK:Addgene 公司。1.2细胞培养1.2.1 293FT细胞培养 使用DMEM培养基(Gibco,美国),添加10%胎牛血清(北京元
18、亨圣马生物科技有限公司,中国)及双抗(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)(Cytiva,美国),置于37,体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。1.2.2 H9细胞培养 细胞种在预先铺好 Matrigel胶(CORNING,美国)的六孔板上,使用mTeSR 培养基(Stem cell,加拿大),含双抗(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)(Cytiva,美国),置于37,体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。1.2.3 诱 导 H9 细 胞 分 化 为 DE H9 细 胞 以5104 cells/cm2 密度传代到预先铺好 Matrigel 胶的六孔板上,细胞贴壁生长
19、24 h后换为DE诱导第1天的培养基,配方为:RPMI 1640(Gibco,美国)添加 2%B-27(Gibco,美国)、100 ng/mL ACTIVIN A(Novoprotein,中国)和 50 ng/mL WNT3a(Novoprotein,中国)。细胞继续贴壁生长24 h后换为DE诱导第 2-4天培养基,配方为:RPMI 1640(Gibco,美国)添加 2%B-27(Gibco,美国)、100 ng/mL ACTIVIN A(Novoprotein,中国)。此后每隔24 h换液,直到第4天细胞分化为DE细胞。诱导过程中,细胞均置于37,体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。1.3建
20、立稳定敲低DANCR的H9细胞株1.3.1 病毒包装 在 T75 细胞培养瓶转染 293FT细胞,细胞密度为 80%到 90%。慢病毒包装质粒pMDG、pRSV和pMDLg/pRRE按1:1:2比例混匀加至900 L Opti-MEM(Gibco,美国)中,混匀后室温静置5 min,加入lipo8000转染试剂(上海碧云天生物技术有限公司,中国),混匀后室温静置15 min,加入到T75中的293FT细胞,置于37、5%CO2的培养箱中培养。12 h 后换液,收集换液后 48 h 和72 h的细胞培养液上清,将上清以3 000g,4,离心10 min。去除细胞沉淀,用0.45 m滤器过滤去除上
21、清中的细胞碎片。取滤液以50 000g,4,高速离心90 min浓缩病毒。去除上清后用1mL无血清培养基重悬病毒沉淀,将病毒分装,直接用于感染细胞或者保存于-80 备用。1.3.2病毒感染H9细胞H9细胞在感染病毒前一天铺板,感染时密度为 20%到 30%。病毒从-80 拿出后置于冰上融化,3 000g离心2 min,取上清加至细胞培养基中,并加入 polybrene使其终浓度为8 g/mL。放入37、5%CO2的培养箱中培养,感染病毒24 h后更换培养基,继续培养。1.3.3 嘌呤霉素筛选阳性细胞 慢病毒干扰对照质粒 IMIRXPress、慢病毒干扰质粒 shDANCR#1和shDANCR#
22、2 都具有嘌呤霉素抗性,因此可以使用嘌呤霉素筛选阳性细胞。使用mTeSR 培养基,含双抗(100 U/mL 青霉素和 0.1 mg/mL 链霉素)和1 g/mL嘌呤霉素筛选细胞 48 h,PBS洗涤两遍后换液mTeSR 培养基继续培养。1.4细胞总RNA提取、逆转录和qPCR1.4.1 细胞总 RNA提取 移除细胞培养基,加入500 L RNAzol RT(MRC公司,美国)裂解10 min,将裂解液体转移至1.5 mL EP管中;向每份样品中加入200 L DEPC水,充分混匀,冰上静置15 min;4,12 000g离心15 min,用200 L RNase-free枪头分次吸取共600
23、L上清至RNase-free EP管中;向吸出的上清加入600 L 异丙醇,充分混匀,冰上静 置 15 min 使 RNA 沉 淀;4 ,12 000g 离 心15 min,此时可见管底有白色沉淀,沉淀即为RNA,小心去除上清,加入 75%乙醇洗涤沉淀,4,5 000 g离心5 min,小心去除上清;加入75%乙醇再次洗涤沉淀,4,5 000g离心5 min。彻底吸除上清,开盖置于冰上晾干至沉淀边缘透明,加入适量 DEPC 水溶解沉淀,于冰上溶解 15 min,使用Nanodrop测定RNA浓度及纯度。1.4.2 逆转录 取 1g RNA用 RNase-free水调整体积至10 L,42 5
24、min 去除基因组DNA。加入10 L 2NovoScript Plus 1st Strand cDNA 混 合 均匀,50 15 min;75 5 min终止反应。(逆转录试剂盒,Novoprotein,中国)。47第45卷中山大学学报(医学科学版)1.4.3 qPCR 取 1 L cDNA、1 L qPCR-F(0.5 mol/L)、1 L qPCR-R(0.5 mol/L)、5 L 480mix(2)、2 L ddH2O 配制 qPCR 反应体系;反应条件是:95 反应10 min,95 反应10 s,60 反应20 s,72 反应20 s,设置40个循环。(荧光定量PCR试剂,Roch
25、e公司,瑞士)。本文所用引物由生工生物工程有限公司合成,引物序列见附表1。1.5细胞总蛋白提取和蛋白免疫印迹1.5.1 细胞总蛋白提取 移除细胞培养基,用PBS洗涤两次,用EDTA消化细胞,收取细胞沉淀,每六孔板收集细胞加入150 L RIPA裂解液(Millipore,美国),裂解液在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物(上海碧云天生物技术有限公司,中国),冰上裂解10 min。10 000g,4 离心15 min,将上清转移至新的 1.5 mL EP管中。使用 BCA试剂盒(Thermo,美国)测定蛋白质样品浓度。向蛋白质样品中加入4loading buffer,使loading buffer终浓
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