基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析.pdf
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1、基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析王佳琦,王欣,邓小梅,吴蔼民(华南农业大学林学与风景园林学院,广东广州510642)摘要:【目的目的】花榈木 Ormosia henryi 是重要的木本药用植物。研究花榈木萜类次生代谢物积累规律,分析萜类生物合成通路和相关的关键酶基因,对花榈木药用价值的开发具有重要意义。【方法方法】采用液相色谱-质谱联用技术与高通量转录组学测序,利用生物信息学分析方法从差异代谢产物和表达基因中寻找萜类生物合成的关联酶基因。【结果结果】代谢组数据中共检测到了 15 种萜类化合物,其中含有甘草次酸、齐墩果酸和芳樟醇等具有药用活性的物质,多数在叶片中相对含量高于其他组织
2、部位。转录组数据筛选出 49 个与萜类合成有关的候选基因,分析后发现:甲羟戊酸(MVA)途径中的差异基因在幼叶中表达较高,甲基赤藓糖磷酸酯(MEP)途径的差异基因在老叶中表达较高。根据加权基因共表达网络(WGCNA)分析,发现 MYB、WRKY、bHLH 和 HB-HD-ZIP 等转录因子家族在花榈木的萜类合成中起重要作用,并推测了 6 个可能与萜类物质生物合成有关的转录因子,即 HB-HD-ZIP(c64527.graph_c1)、GRF(c76195.graph_c0)、DBB(c66970.graph_c2)、DBB(c75593.graph_c0)、HB-HD-ZIP(c63393.g
3、raph_c0)和 C3H(c70385.graph_c1)。【结论结论】从花榈木代谢组和转录组数据库中初步获得了重要的萜类物质及可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明花榈木萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。图 8 表 1 参 36关键词:花榈木;代谢组;转录组;萜类化合物;生物合成中图分类号:S722文献标志码:A文章编号:2095-0756(2023)05-0970-12AnalysisofcandidategenesforterpenesynthesisinOrmosia henryibasedonmetabolomeandtranscriptomeWANGJi
4、aqi,WANGXin,DENGXiaomei,WUAimin(CollegeofForestryandLandscapeArchitecture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,Guangdong,China)Abstract:ObjectiveOrmosia henryiisanimportantwoodymedicinalplant.Thisstudyaimstoexploretheaccumulationpatternofterpenesecondarymetabolitesandanalyzetheterpenebio
5、synthesispathwayandrelatedkey enzyme genes,which is of great significance to the development of medicinal value in O.henryi.Method Liquid chromatography-mass spectrometry and high-throughput transcriptomic sequencing wereusedtofindtheassociatedenzymegenesofterpenebiosynthesisfromdifferentiallyexpres
6、sedgenesbasedonbioinformaticsanalysis.ResultAtotalof15terpenecompoundsweredetectedinthemetabolomicdataandtheycontainedenoxolone,oleanolicacid,linaloolandothersubstanceswithmedicinalactivity,mostofwhichwererelativelyhigherinleavesthaninothertissueparts.Transcriptomedatascreened49candidategenesrelated
7、toterpenesynthesis,andafteranalysisitwasfoundthatdifferentialgenesintheMVApathwaywerehighlyexpressedinyoungleaveswhiledifferentialgenesintheMEPpathwaywerehighlyexpressedinoldleaves.BasedonWGCNAanalysis,itwasfoundthattranscriptionfactorfamiliessuchasMYB,WRKY,bHLH收稿日期:2022-11-28;修回日期:2023-03-09基金项目:广东
8、省林业科技创新项目(2017KJCX028)作者简介:王佳琦(ORCID:0000-0002-6444-7077),从事花榈木次生代谢研究。E-mail:。通信作者:吴蔼民(ORCID:0000-0001-8322-8833),教授,博士,从事林木生物学研究。E-mail:浙江农林大学学报,2023,40(5):970981Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20220737andHB-HD-ZIPplayedanimportantroleinterpenesynthesisofO.henryi,and
9、6transcriptionfactorsthatmightberelatedtoterpenebiosynthesiscontentwerepredicted,namelyHB-HD-ZIP(c64527.graph_c1),GRF(c76195.graph_c0),DBB(c66970.graph_c2),DBB(c75593.graph_c0),HB-HD-ZIP(c63393.graph_c0)andC3H(c70385.graph_c1).Conclusion Important terpenes and candidate key enzyme genes that maypart
10、icipateinthebiosynthesispathwayoftheseterpeneshavebeenpreliminarilyobtainedfromthedatabaseofmetabolomicsandtranscriptomeofO.henryi.Ch,8fig.1tab.36ref.Key words:Ormosia henryi;metabolome;transcriptome;terpenoids;biosynthesis花榈木 Ormosia henryi 为豆科 Leguminosae 红豆属 Ormosia 重要木本药用植物,主要产于东南亚和南美洲,属于国家二级保护植
11、物,在野外处于中度濒危状态1。花榈木常以根、根皮及茎、叶入药。全国中草药汇编记述,其性味归经为辛、温,有毒,具有活血化瘀、祛风、消肿之功。研究发现:红豆属植物含有生物碱、黄酮、苯丙素、萜类和挥发油等多种化学成分,其中萜类化合物是一类重要的活性物质2。迄今为止,已从红豆属不同植物中发现大量的萜类化合物,如丁香酚、苯乙醇、榄香素和棕榈酸等化合物,并发现多种物质具有消炎、抗氧化、抗菌的作用34。萜类物质是多种药用植物的主要活性化合物,并且是天然化合物中规模最大种类最多的一类物质56,了解花榈木中萜类物质能够提高对花榈木的药用认知。植物萜类化合物主要由甲基赤藓糖磷酸酯(MEP)途径或甲羟戊酸(MVA)
12、途径产生的二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)生成7。萜类化合物分子骨架是基于异戊二烯或其异构体二甲基烯丙基焦磷酸 C5 单元构成的,根据骨架碳链长度的不同,主要分为半萜、单萜、二萜、三萜等几种类型的萜类化合物8。MEP 途径仅发生在质体中,MVA 途径却分布在细胞质、内质网和过氧化物酶体之间9。IPP 与 DMAPP 通过戊烯基转移酶的催化,缩合产生萜类化合物前体物质香叶酰二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。其中 GPP 是合成单萜类化合物前体物质,GGPP 是合成二萜前体物质,FPP 则是合成倍半萜和三萜化合物的前体物质101
13、1。随后通过萜类合成酶(TPS)和氧角鲨烯环化酶(OSCs)催化前体形成不同种萜类化合物,这 2 种酶的多样性使得萜类化合物的种类有很多1213。TPS 基因家族主要分为 7 个亚家族,分别命名为 TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h。其中 TPS-a、TPS-b和 TPS-g 属于被子植物特有分支,这 3 个分支完全由专门的单萜、倍半萜或二萜生物合成基因组成,主要在植物生态相互作用中起作用。TPS-d 是裸子植物特异性亚家族,主要包含特异性代谢的裸子植物 TPSs14。TPS-c 和 TPS-e/f 是被子植物与裸子植物所共有的亚家族,TPS
14、-c 分支成员只包含“DXDD”序类,是单功能柯巴基焦磷酸合酶(CPS)。与 TPS-c 类似,TPS-e/f 分支成员只包含“DDXXD”序类,是单功能的贝壳杉烯合成酶(KS)1516。植物 OSC 家族是一个超基因家族,主要包含达玛烯二醇合成酶(DS)17、-香树脂醇合成酶(-AS)18、香树脂醇合成酶(-AS)19和羽扇豆醇合成酶(LUS)20。近些年来对萜类的研究越来越广泛,但是豆科植物花榈木中的萜类化合物种类以及生物合成情况却未见报道。本研究利用代谢组学测序数据首次对花榈木中的萜类物质进行鉴定,并结合转录组测序结果,利用生物信息学方法分析花榈木中萜类的主要合成情况,分析相关基因在花榈
15、木不同组织部位中的表达水平,为研究花榈木的药用活性物质以及花榈木中萜类的代谢调控途径奠定基础。1材料与方法1.1材料2021 年 4 月 23 日于华南农业大学(中国广州)苗圃中采集 3 年生花榈木新鲜的根、茎、树皮、老叶和幼叶 5 个组织部位样品,每样品重复 4 次,纯净水冲洗干净,立即在液氮中冷冻,并分成 2 个部分,一部分立即在80 下保存用于总 RNA 提取,另一部分在真空下冷冻干燥用于代谢物提取。1.2代谢组测定将采摘的根、茎、树皮、老叶和幼叶样品冻干磨粉后,精确称量各个样品粉末 0.5g,分别用 5第 40 卷第 5 期王佳琦等:基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析971
16、mL 体积分数为 80%的 HPLC 级甲醇提取过夜,其中内标为 1molL1的白杨素。4 下 12000g 离心30min,取上清液装入样品瓶中,进行超高效液相色谱质谱(UHPLCQ-TOF/MS)分析。为了分离花榈木不同器官的代谢物,采用超高效液相色谱串联质谱法(QExactivePlus)进行测定。为保证平行试验每个样品平行 4 针。将 1L 样品进入 2.1mm100.0mm、1.9m 粒径的 HypersilGOLD 色谱柱,柱温 30,流速 0.3mLmin1。流动相 A 为体积分数 0.1%的 HPLC 级甲酸,流动相 B 是 HPLC 级乙腈。梯度洗脱:02.0min,010%
17、流动相 B;2.010.0min,10%55%流动相 B;10.010.1min,55%80%流动相 B;10.113.0min,80%流动相 B;13.014.0min,80%95%流动相 B;14.018.0min,95%10%流动相 B。全扫描质谱和数据关联扫描(dd-MS2)的分辨率分别设置为 70000 和 17500,在正负离子模式下均使用加热的 ESI 源。在正负模式下,喷雾电压被设定为 3.5 和 3.2kV。毛细管温度被设定为 320,辅助气体加热器的温度被设定为 350。使用 CompoundDiscoverer3.2 对原始数据进行分析,然后根据综合分子量、质荷比(m/z
18、)、保留时间(RT)和二级光谱,与代谢物数据库 mzCloud、mzVault 和 Chemspider 进行对比。1.3RNA 提取与文库构建总 RNA 由 RNAprepPureAssay 试剂盒提取,RNA 质量用 NanoPhotometer分光光度计测定。为了进行转录组测序,样品被送到百迈客生物技术公司。库的制备在 IlluminaHiseq2000 平台上进行测序,并产生成对的读长(reads)。首先,使用内部的 perl 脚本处理 fastq 原始数据,以去除含适配器的读数、含 ploy-N 的读数和低质量读数。经过 Trinity 软件组装获得一个非冗余的基因数据库(unive
19、rsalgene,unigene),并进一步使用 HMMER软件与 Pfam 数据库比对,获得 unigene 的注释信息。1.4差异基因和基因功能分析以常用的基因表达水平估算方法中每千个碱基转录每百万映射读取的片断(fragmentsperkilobasemillion,FPKM)值进行表达量统计。使用错误发现率(falsediscoveryrate,FDR)0.01和|log2CF|2(CF为差异倍数,foldchange)的阈值,写入 R 中的 DESeq2 包,对花榈木不同部位样本进行差异基因表达分析21。使用 TBtools 构建差异显著基因(DEGs)的热图,京都基因和基因组百科全
20、书(KEGG)对DEGs 的富集分析是使用 R 中的 ClusterProfiler 包进行的,加权基因共表达网络(WGCNA)是在 R 包WGCNA 的帮助下进行的,并使用相关 P 值建立统计学意义。2结果与分析2.1代谢组数据分析根据总离子流图所得到的化合物精确相对分子质量、出峰时间、二级碎片信息,与 mzCloud 和mzVault 数据库比对,共鉴定出 15 种萜类化合物(表 1)。为了分析花榈木不同组织部位中萜类化合物的分布情况,对 5 个部位的萜类化合物的相对含量进行了热图分析(图 1A),发现不同部位的萜类相对含量差别较大。能明显看出幼叶、老叶与根中萜类相对含量较高,与之相反的是
21、茎与皮中相对含量比较少,并发现甘草次酸(enoxolone)、齐墩果酸(oleanolicacid)、芳樟醇(linalool)和二氢丹参酮(dihydrotanshinone)等具有抗氧化、抗炎免疫调节、抗心血管疾病和镇定作用的萜类化合物22,表明萜类化合物可能是花榈木中主要的药用活性物质。2.2转录组数据分析为了筛选花榈木中与萜类生物合成相关的潜在基因,利用 RNA-seq 对花榈木 5 个部位的所有转录组进行分析。使用 IlluminaHiseq2000 平台进行测序,在去除低质量和短的读数后,总共获得了 1.92.4M 的高质量待分析数据,共获得 96302 个最长转录本,并与 NR、
22、eggNOG、TrEMBL、Pfam、SwissProt、KEGG、COG、KOG 及 GO 等 9 个数据库比对,确定编码序类有 47809 条,并对其进行功能注释。计算出 FPKM 值,代表每个基因的表达水平。对花榈木 5 个部位的转录组进行差异基因分析,共得到13840 个差异显著基因(DEGs)。在差异基因分析中发现,与其他 3 个部位样本相比,叶的特异差异基因更多,茎中的特异差异基因最少(图 2)。2.3参与萜类生物合成相关基因表达分析根据其他物种萜类生物合成信息,花榈木萜类物质合成途径大致可分为萜类前体物质的合成、萜骨972浙江农林大学学报2023 年 10 月 20 日架的合成和
23、后修饰 3 个阶段,其中萜类化合物的前体 GPP、FPP 和 GGPP 主要来自植物的 MVA 和MEP 途径。MVA 通路共鉴定到 8 个基因,包括 2 个乙酰辅酶 A 乙酰转移酶(AACT,c68943.graph_c2,c73242.graph_c0)、2 个羟甲基戊二酰辅酶 A 合成酶(HMGS,c57495.graph_c0,c70166.graph_c1)、1 个羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(HMGR,c68938.graph_c1)、1 个甲羟戊酸激酶(MK,c70988.graph_c0)、1 个磷酸甲羟戊酸激酶(PMK,c71400.graph_c0)、1 个甲羟戊酸焦磷酸脱
24、羧酶(MVD,c76163.graph_c2);MEP通路共鉴定到 10 个基因,包括 4 个 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS,c62607.graph_c0,c70494.graph_c2,c75298.graph_c5,c75577.graph_c0)、1 个 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(DXR,c71705.graph_c2),1 个 4-焦磷酸胞苷-2-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK,c73279.graph_c4)、1 个 2-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合酶(MDS,c62387.graph_c0)、1 个羟甲基丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS,c56719
25、.graph_c0)、2 个羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶(HDR,c29394.graph_c0,c70095.graph_c0)。为了更直观地比较萜类生物合成途径主要基因在不同组织中的表达情况,采用 FPKM 值对花榈木不同组织部位的合成途径基因表达量作图。发现参表1花榈木中萜类化合物质谱信息Table1Massspectralinformationofterpenoidsin O.henryi名称分子式质荷比保留时间/min峰面积根茎老叶皮幼叶齐墩果酸C30H48O3456.3608713.411264762138689614439205545014461185143二氢丹参酮C18H14
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