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基于磁球的竞争适配体法检测中药中赭曲霉素A.pdf
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1、基于磁球的竞争适配体法检测中药中赭曲霉素 高仕超,秦美君,李 赟,郭丽敏(山西中医药大学,山西 晋中)收稿日期:基金项目:国家自然科学基金();山西省中医药管理局科研项目();山西省高等学校教学改革创新项目();山西中医药大学科技创新能力培育计划项目()作者简介:高仕超(),男,硕士生,从事中药质量鉴定研究。:通信作者:郭丽敏(),女,副教授,硕士生导师,从事中药质量鉴定研究。:(),:摘要:目的 基于磁球的竞争适配体法检测中药中赭曲霉素。方法以赭曲霉素 的适配体为识别元件,荧光素 为荧光探针,磁球为载体,发展了一种竞争的适配体法检测赭曲霉素。标记的适配体()与修饰在磁球上的适配体互补链()杂
2、交而结合在磁球上,并随着磁性分离离开溶液,溶液的荧光信号弱;在溶液中加入赭曲霉素 后,赭曲霉素 与 竞争性的与 结合,与赭曲霉素 结合的 留在溶液中,从而使溶液的荧光信号增强。结果 做互补链,在 的、的 和 的缓冲溶液下,方法检出限低至 ,展现出良好的选择性,同时只需对样品进行简单处理即可实现赭曲霉素 在中药中的检测。结论 本实验将适配体技术和纳米材料结合并应用于中药中真菌毒素的检测,为中药质量鉴定提供了新思路。关键词:赭曲霉素;适配体;中药;荧光;磁球中图分类号:文献标志码:文章编号:():赭曲霉素是一种真菌毒素,其中赭曲霉素 是最重要的霉菌代谢产物,可引起肝、肾坏死性病变,还具有致畸性,国
3、际癌症研究机构将其定义为 类致癌物。中国和欧盟对许多食品和饲料中赭曲霉素 进行了限定。年版 中国药典 规定了可以使用 法和 法测定中药中的赭曲霉素,弥补了我国对中药中赭曲霉素 的检测空白。中药中赭曲霉素 的检测主要有色谱法、免疫分析法。色谱法检测灵敏度高,但样品前处理复杂;免疫分析法操作简单、快速,但抗体制备困难、成本高。适配体是体外筛选得到的 或 序列,易于体外大量合成,成本低,可以和光学、电化学等技术结合,广泛应用于细胞成像、生物检测等领域,且适配体易于标记荧光物质而活性不受影响。本实验以磁球为载体,发展了一种竞争性适配体分析法检测赭曲霉素,见图。当溶液中不存在赭曲霉素 时,标记的适配体(
4、)与 通过碱基互补配对,形成双链并结合在磁球上,随磁性分离过程被磁球带走,荧光信号很低;当溶液中存在赭曲霉素 时,赭 曲 霉 素 与 竞 争 性 的 结 合,并将 留在溶液中,荧光信号得以保留。因此,通过检测荧光信号的变化实现对赭曲霉素 的定量检测。图 基于磁球的竞争适配体荧光法检测赭曲霉素 原理图 材料赭曲霉素、氨基酸、华法林、香豆素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮均购自美国 公司;(批号)、(批号)、(批号)、(批号)、(批号)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;链霉亲和素包被的磁球购自美国 公司。其余试剂均为分析纯;水为超纯水。标记有 的赭曲霉素 适配体()与其互补序列()由上海生工生物工程
5、股份有限公司提供,序列见表。木槿皮(批号)、桔梗(批号)、槟榔(批号)均购自山西维康堂中药饮片有限 年 月第 卷 第 期中 成 药 表 寡核苷酸序列列表名称序列 公司。型荧光光度计(美国 公司);型涡旋混匀器(杭州米欧仪器有限公司);型超纯水机(四川优普超纯科技有限公司);孔高速微量离心机 鼎昊源(天津)生物科技有限公司。方法 赭曲霉素 检测方法取链酶亲和素包被的磁球 于离心管中,磁性分离,吸取上清液,用缓冲液(溶液 ,含 ,)洗涤磁球 次,加入 生物素标记的核酸适配体互补序列(),室温下反应 ,将 修饰的磁球用缓冲溶液 洗涤后备用。将含有 缓冲液 (溶液 ,含 ,)与 含有赭曲霉素 的缓冲溶
6、液 在室温下反应 ,加入 修饰的磁球,两者混合后室温下反应 ,磁性分离后,在荧光分光光度计下测定荧光强度。根据本实验所选 的荧光强度,设定激发和发射狭缝宽度为 ,由实际测定 的最大激发波长为 ,发射波长范围 ,得到完整荧光光谱。特异性试验 选择与赭曲霉素 结构相近的氨基酸、华法林、香豆素,以及赭曲霉素 的可能共存物赭曲霉素 和玉米赤霉烯酮作为干扰试剂,进行特异性试验,分别在、浓 度 下 进 行 实 验,方 法 同“”项。加样回收率试验分别取 木槿皮、桔梗、槟榔,加入 水,煮沸 ,离心 ,用缓冲溶液将上清液稀释 倍后,加入赭曲霉素,按“”项下方法测定其荧光信号。结果 可行性实验 由图 可知,当体
7、系中不存在赭曲霉素 时,荧光信号弱,说明大部分的 都结合在了磁球上;当加入目标物赭曲霉素 后,体系的荧光信号明显增高,说明赭曲霉素 与 特异性结合,将 留在了溶液中,设计方案可行。实验条件的优化 的选择 赭曲霉素 核酸适配体互补序列 的长度是影响荧光信号强度的一个重要因素,越短(碱基数越少),其与 的结合能力就弱,则在没有赭曲霉素 的情况下,通过磁性分离带走的 图 可行性分析 就越少,体系的荧光信号降低不明显,使得检测背景过高;如果 太长,其与 结合能力过强,又会增强 与赭曲霉素 结合的难度,使得体系在有赭曲霉素 存在下荧光信号也不会太高,这 种情况都会影响检测的灵敏度。基于此,本实验设计了
8、条分别含有 个()、个()、个()、个()、个()碱基数的赭曲霉素 适配体互补序列进行考察。棕色部分为不存在赭曲霉素 时的荧光信号值,绿色部分为加入赭曲霉素 时的信号值,由图 可知,当碱基数为 时(),种体系的荧光信号差值最高,说明 与 的结合能力适当,既能与 有效结合,又能在赭曲霉素 存在下与 及时解离,保障高灵敏度,故本实验选择 为最佳互补链。浓度 既是赭曲霉素 的识别元件,又是荧光探针,它的浓度对检测体系影响很大。如果 浓度过低,检测信号就低,如果 浓度过高,会使得体系背景信号高,两者都会降低检测灵敏度。浓度对体系的荧光信号比值 (,其中 为加入赭曲霉素 时的荧光信号,为没有加入赭曲霉素
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