基于代谢组学探讨快松饮防治便秘的作用机制.pdf
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1、中国药房 2023年第34卷第17期China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17 2121 基于代谢组学探讨快松饮防治便秘的作用机制 于小聪 1,刘沈林 2,王泽琨 1,李丹婷 1,赵毅萌 1,陈辰 3,陈亚军 3,束雅春 1#(1.南京中医药大学附属医院药学部,南京210029;2.南京中医药大学附属医院脾胃病科,南京210029;3.南京市妇幼保健院检验科,南京210004)中图分类号 R965;R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2023)17-2121-07DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.17.13摘要 目的
2、探讨快松饮防治便秘的作用机制。方法 采用复方地芬诺酯片建立小鼠和大鼠的慢传输型便秘模型。取2批小鼠,分别分为空白组,模型组,阳性对照组(麻仁软胶囊,0.64 g/kg),快松饮低、中、高剂量组(3.2、6.4、12.8 g/kg),每组10只;通过小鼠肠推进实验、小鼠排便实验考察快松饮防治便秘的效果。取大鼠分为空白组,模型组,阳性对照组(麻仁软胶囊,0.36 g/kg),快松饮低、高剂量组(2.4、4.8 g/kg),每组7或8只;每天给药1次,连续给药1周后,利用超高效液相色谱-飞行时间质谱技术对大鼠血清、尿液进行代谢组学分析。结果 与模型组比较,快松饮高剂量组小鼠墨汁推进率显著升高、5 h
3、内排便数量显著增加(P0.05),快松饮中、高剂量组小鼠的首次排便时间显著缩短、5 h内排便质量显著增加(P0.05或P0.01)。血清代谢组学筛选得到16个差异代谢物(如脯氨酸、丙酰基肉碱、硬脂酰溶血性磷脂酰胆碱等)和6条代谢通路(如鞘磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、鞘糖脂生物合成-乳糖和新内酯系列等);尿液代谢组学筛选得到20个差异代谢物(如前列腺素A2、L-缬氨酸、硬脂酰磷脂酰胆碱、鞘磷脂等)和8条代谢通路(如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,鞘磷脂代谢,丙酮酸代谢等)。结论 快松饮可通过回调硬脂酰溶血性磷脂酰胆碱、硬脂酰磷脂酰胆碱、前列腺素A2、L-缬氨酸、脯氨酸等差异代谢物以及调节多种
4、氨基酸代谢途径、鞘磷脂代谢通路等来发挥改善便秘的作用。关键词 快松饮;便秘;药效学;代谢组学;慢传输型便秘Investigation on the mechanism of Kuaisong yin in the prevention and treatment of constipation based on metabonomicsYU Xiaocong1,LIU Shenlin2,WANG Zekun1,LI Danting1,ZHAO Yimeng1,CHEN Chen3,CHEN Yajun3,SHUYachun1(1.Dept.of Pharmacy,the Affiliated
5、Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,China;2.Dept.of Spleen and Stomach Diseases,the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,China;3.Dept.of Clinical Laboratory,Nanjing Maternal and Child Health Hospital,Nanjing 210004,China)ABSTRACTOBJECTIVE To explore the me
6、chanism of Kuaisong yin in the prevention and treatment of constipation.METHODS Slow transit constipation(STC)model was established with Compound difenoxylate tablet in mice and rats.Two batches of mice were divided into blank group,model group,positive control group(Maren soft capsule,0.64 g/kg),Ku
7、aisong yin low-dose,medium-dose and high-dose groups(3.2,6.4,12.8 g/kg),with 10 mice in each group.The effect of Kuaisong yin on constipation in mice was evaluated by intestinal propulsion experiment and defecation experiment.Rats were divided into blank group,model group,positive control group(Mare
8、n soft capsule,0.36 g/kg),Kuaisong yin low-dose and high-dose groups(2.4,4.8 g/kg),with 7 or 8 rats in each group.They were given relevant medicine once a day for 1 week.The metabonomics of serum and urine of rats were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS technology.RESULTS Compared with model group,the ink
9、 propulsion rate and 5 h defecation volume of mice in Kuaisong yin high-dose group were significantly increased(P0.05);the first defecation time of mice in Kuaisong yin medium-dose and high-dose groups was significantly shortened,and the quality of defecation was significantly reduced within 5 h(P0.
10、05 or P0.01).Serum metabonomics screened 16 compounds(such as proline,propionylcarnitine,hemolytic phosphatidylcholine,etc.)and 6 metabolic pathways(such as sphingomyelin metabolism,arginine and proline metabolism,sphingolipid biosynthesis-lactose and neolactone series).Urine metabonomics screened 2
11、0 different metabolites(such as prostaglandin A2,L-valine,phosphatidylcholine,sphingomyelin,etc.)and 8 metabolic pathways(such as valine,leucine and isoleucine 基金项目 南京市高价值专利组合项目(No.K2020q05)第一作者 硕士。研究方向:中药分析及代谢组学。E-mail:#通信作者 主任中药师,硕士生导师,博士。研究方向:中药健康产品研究与开发。E-mail: 2122 China Pharmacy 2023 Vol.34 No
12、.17中国药房 2023年第34卷第17期biosynthesis,sphingomyelin metabolism,pyruvate metabolism,etc.).CONCLUSIONS Kuaisong yin can play a role in improving constipation by regulating different metabolites such as hemolytic phosphatidylcholine,phosphatidylcholine,prostaglandin A2,L-valine,proline,and regulating metab
13、olic pathways such as multiple amino acid metabolism,sphingomyelin metabolism,etc.KEYWORDSKuaisong yin;constipation;pharmacodynamics;metabolomics;slow transit constipation便秘是一种影响患者健康和生活质量的常见慢性疾病,在人群中的发病率为2%28%。随着年龄的增长,便秘的患病率明显升高,老年人群中有15%20%为便秘患者,其中女性要多于男性12。长期的便秘不仅会造成患者生活质量下降,同时还会危害患者的身体健康,如诱发心脑血管疾
14、病、引起胃肠功能紊乱、引起或加重直肠肛门疾病或结肠癌等34。化学药物针对便秘的治疗虽然可以有效缓解症状,但是从长期来看会引起很多副作用,产生药物依赖。而中医药治疗便秘已有上千年历史,近年来中医药治疗慢性功能性便秘的报道逐渐增多。循证医学研究证实,中医药在治疗功能性便秘方面安全、有效,能改善功能性便秘患者的临床症状,在总体疗效方面较化学药具有明显优势5。快松饮(原麻仁通颗粒)由火麻仁、郁李仁、莱菔子、黑芝麻4味中药组方而成,是江苏省中医院全国名中医刘沈林教授在从医40余年的经验中总结而得的用于治疗便秘的经验方。该方临床疗效确切,但成分与作用机制尚不清楚。代谢组学可以通过定性、定量方法分析生物体受
15、外界刺激或扰动后体内所有代谢物的变化6,这与中医药治疗疾病的“整体观”相符。本研究拟采用慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)动物模型来研究快松饮改善便秘的效果,然后利用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术对大鼠血清、尿液进行代谢组学分析,探讨快松饮改善便秘的作用机制,为其后续研究提供科学的实验依据。1材料1.1主要仪器本研究所用主要仪器有:ExionLC型UPLC仪、Q-Tof 5600+型高分辨质谱仪(美国 AB SCIEX 公司),Heraeus Megafuge 8R型高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher S
16、cientific公司),CPA225D型电子天平(德国Sartorius公司)等。1.2主要药品与试剂本研究所用的主要药品与试剂有:快松饮(江阴天江药业有限公司,批号20210321,规格6 g/包),麻仁软胶囊(佛山手心制药有限公司,批号2101524,规格0.6 g/粒),复方地芬诺酯片(常州康普药业有限公司,批号2005020,规格为每克含盐酸地芬诺酯2.5 mg、硫酸阿托品0.025 mg);乙腈、甲醇均为质谱级,甲酸为分析级,水为屈臣氏蒸馏水。1.3实验动物本研究所用动物有SPF级ICR雄性小鼠120只(体重 2024 g)和 SPF 级 SD 雄性大鼠 39 只(体重 18020
17、0 g),均由南通大学实验动物中心提供,动物生产许可证号为 SCXK(苏)2019-0001。动物均于温度(224)、相对湿度(5515)%的条件下饲养。本动物实验经南京中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准后实施(批件号为2021DW-13-01)。2方法2.1小鼠药效实验2.1.1小鼠肠推进实验将60只小鼠随机分为空白组,模型组,阳性对照组(麻仁软胶囊0.64 g/kg,相当于10.6倍临床等效剂量),快松饮低、中、高剂量组(3.2、6.4、12.8 g/kg,分别为2.7、5.3、10.6倍临床等效剂量),每组10只。空白组和模型组小鼠灌胃等体积水,各给药组小鼠灌胃相应药物(均以蒸馏水
18、为溶剂配制药液);每天给药1次,连续14 d。实验期间小鼠自由饮食、摄水,每周记录其体重。第14天灌胃结束后,各组小鼠禁食不禁水24 h。在第15天,以墨汁为溶剂配制各组药液,空白组小鼠灌胃等体积水,其余各组小鼠均先灌胃复方地芬诺酯片(4 mg/kg,以水为溶剂)7,建立STC小鼠模型。30 min 后,各给药组小鼠再次灌胃相应药物(以墨汁为溶剂),模型组和空白组小鼠灌胃等体积墨汁。25 min后立即脱颈椎处死小鼠,打开腹腔分离肠系膜,剪取上端自幽门下端至回盲部的肠管,置于托盘上,轻轻将小肠拉成直线,测量肠管长度并记为小肠总长度;从幽门至墨汁前沿的距离为墨汁推进长度。计算墨汁推进率:墨汁推进率
19、(%)墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)100%。2.1.2小鼠排便实验另取60只小鼠按“2.1.1”项下方法分组、造模、给药和灌胃墨汁。每只小鼠单独放在笼内饲养,笼底放置1张白纸。从灌胃墨汁时开始计时,记录每只小鼠首次排便时间,并记录和观察小鼠5 h内的粪便质量和粪便数量。2.2大鼠代谢组学研究2.2.1分组、造模与给药将39只大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组(麻仁软胶囊0.36 g/kg,相当于6倍临床等效剂量)和快松饮低、高剂量组(快松饮2.4、4.8 g/kg,分别为3、6倍临床等效剂量)。空白组大鼠为7只,其余各组大鼠均为8只。适应性喂养3 d后,空白组大鼠灌胃水,其余各
20、组大中国药房 2023年第34卷第17期China Pharmacy 2023 Vol.34 No.17 2123 鼠灌胃复方地芬诺酯片(8 mg/kg,溶剂为水)建立STC模型8,连续灌胃14 d。每天观察大鼠生活、毛发状态,第14天灌胃完成后,将大鼠放入代谢笼中收集其24 h粪便,记录粪便数量及质量。若空白组与模型组大鼠24 h粪便数量、质量差异均具有统计学意义则表明造模成功8。造模成功后,空白组大鼠继续灌胃水;其余各组大鼠均先灌胃复方地芬诺酯片(8 mg/kg),1 h后模型组大鼠灌胃水,其余各给药组大鼠灌胃相应药物(以水为溶剂);每天灌胃水/药物1次,连续1周。实验期间让大鼠自由饮食、
21、摄水,每周记录其体重。2.2.2生物样本收集及处理末次灌胃后将大鼠放入代谢笼,第2天收集其24 h尿液、粪便,分装放置于80 冰箱中储存备用。收集尿液和粪便后,空白组大鼠灌胃水;模型组大鼠灌胃复方地芬诺酯片;给药组大鼠先灌胃复方地芬诺酯片,1 h后灌胃相应药物。30 min后采集各组大鼠眼眶血,将血样于室温下放置1 h,以3 500 r/min离心10 min,取上清液,再在4 下以14 000 r/min离心10 min,收集上清液,分装,在80 冰箱中储存备用。2.2.3血清样品的制备取80 冰箱中冻存的血清样本,室温解冻。取200 L解冻后的血清样本于2 mL离心管中,加入600 L 乙
22、腈,涡旋 60 s,于 4 下以 12 000 r/min 离心 10 min,取上清液,转移至2 mL离心管中,室温下氮吹至干。残渣加入100 L乙腈复溶,于4 下以12 000 r/min离心10 min,取上清液,待测。取上述39只大鼠血清样本各40 L于10 mL离心管中混合,加入4 680 L乙腈,按血清样品的处理方式处理,室温下氮吹至干。残渣加入780 L乙腈复溶,于4 下以12 000 r/min离心10 min,取上清液,得到质量控制(quality control,QC)样本。2.2.4尿液样品的制备取80 冰箱中的尿液样本,室温解冻。取 400 L解冻的尿液样本于2 mL离
23、心管中,加入1 200 L乙腈,涡旋60 s,于4 下以12 000 r/min离心10 min,取上清液,转移至2 mL离心管中,室温下氮吹至干;残渣加入 300 L 乙腈复溶,于 4 下以 12 000 r/min 离心 10 min,取上清液,待测。取上述39只大鼠尿液样本各50 L于10 mL离心管中混合,加入5 850 L乙腈,按上述尿液样品处理方式处理,室温下氮吹至干;残渣加入1 463 L 乙腈复溶,于 4 下以 12 000 r/min 离心 10 min,取上清液,得到QC样本。2.2.5色谱与质谱条件色谱条件:采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(100 m
24、m2.1 mm,1.8 m),以0.05%甲酸溶液(A)-乙腈(B)为 流 动 相 进 行 梯 度 洗 脱(02 min,15%B18%B;27 min,18%B35%B;710 min,35%B55%B;1022 min,55%B82%B;2223 min,82%B99%B;2324 min,99%B;2424.1 min,99%B15%B;24.127 min,15%B);流速为 0.3 mL/min;柱温为35;进样量为2 L。质谱条件:数据采集选用全扫描自动模式,离子源为电喷雾离子源(ESI),在正(ESI+)、负(ESI)离子模式下扫描,扫描范围为质荷比(m/z)501 000。喷雾
25、气压力为55 psi,辅助加热气压力为55 psi,气帘气压力为35 psi;温度为500;离子化电压为4 500 V,去簇电压为50 eV(ESI+)、60 eV(ESI)eV;TOF-MS模式下设置碰撞电压为10 eV;IDA-MS/MS条件下设置碰撞电压为35 eV,碰撞电压差为15 eV。2.2.6数据处理将采集所得代谢组学质谱原始数据通过Analysis Base File Converter软件转化为.abf格式的文件,随后通过MS-DAIL3.9软件以及SEERF平台(https:/slfan2013.github.io/SERRF-online/)进行色谱峰对齐、峰过滤、归一化
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