基于成纤维细胞的激活JAK2_STAT3信号通路探讨生地黄提取物对过敏性紫癜的机制研究.pdf

1188 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 DOI:10.13463/ki.jlzyy.2023.10.017基于成纤维细胞的激活 JAK2/STAT3 信号通路探讨生地黄提取物对过敏性紫癜的机制研究陈 宏1，邓琳千2，陈 群3，黄冬成4，宋倩男1*（1.黑龙江中医药大学附属第一医院儿科，哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学研究生院，哈尔滨 150040；3.黑龙江省哈尔滨市阿城区人民医院检验科，哈尔滨 150030；4.黑龙江大三源乳品机械有限公司，哈尔滨 150001）摘要：目的 探讨生地黄对过敏性紫癜（HSP）小鼠可能的作用机制研究。方法 将60只SPF级雄性实验小鼠，平均随机分成对照组、模型组、西咪替丁组（0.1 g/mL）、生地黄提取物低、中、高剂量组（10、20、30 mg/mL）。除对照组小鼠外，其余小鼠造模 HSP，成功后按实验要求每日灌胃等量对应生地黄提取物，模型组和对照组灌胃等量生理盐水，连续 21 d。结束后，采用碘酸雪夫染色肾脏组织的病理学变化，采用 ELISA 试剂盒检测小鼠血清IFN-、IL-2、IL-4、IL-10水平，Western blot法检测小鼠肾组织中p-JAK2（Janus Kinase 2，JAK2）、p-STAT3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的蛋白相对表达。结果 西咪替丁组和生地黄提取物组病理评分都明显远低于模型组，给药后小鼠肾脏组织学损害显著减轻。与对照组比较，模型组小鼠IFN-、IL-2表达均明显降低，IL-4、IL-10 表达均明显升高（P 0.05）；与模型组比较，西咪替丁组、生地黄提取物低、高剂量组小鼠 IFN-、IL-2 水平均升高，IL-4、IL-10 水平均降低（P 0.05），且与生地黄提取物低、中剂量组相比，生地黄提取物高剂量组表达更明显（P 0.05）。与对照组相比，模型组小鼠肾组织中 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达均显著升高（P 0.01）；生地黄提取物高剂量组小鼠肾组织中 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达明显低于西咪替丁组、生地黄提取物低、中剂量组（P0.05）。结论 生地黄提取物具有显著的抗氧化活性和抗炎作用，可减轻HSP小鼠的症状，其作用机制可能与抑制 JAK2/STAT3 信号通路激活，从而调节 p-JAK2 和 p-STAT3 蛋白的表达水平有关。关键词：过敏性紫癜；生地黄；JAK2；STAT3；肾损伤 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1003-5699(2023)10-1188-05Mechanism of unprocessed rehmannia root extract on Henoch-Schnlein purpura based on Mechanism of unprocessed rehmannia root extract on Henoch-Schnlein purpura based on activation of JAK2/STAT3 signaling pathway by fibroblastsactivation of JAK2/STAT3 signaling pathway by fibroblastsCHEN Hong1,DENG Linqian2,CHEN Qun3,HUANG Dongcheng4,SONG Qiannan1*(1.Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Graduate School of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;3.Department of Clinical Laboratory,Acheng District People s Hospital,Harbin 150030,China;4.Heilongjiang Dasanyuan Dairy Machinery Co.,Ltd.,Halbin 150001,China)Abstract:ObjectiveAbstract:Objective To explore the possible mechanism of unprocessed rehmannia root on Henoch-Schnlein 基金项目：中国博士后科学基金第 13 批特别资助项目（2020T130178）作者简介：陈 宏（1977），男，博士，主要从事变态反应性疾病研究*通信作者：宋倩男，电子信箱-实验研究1189 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 过敏性紫癜即变应性紫癜（Henoch-Schnlein purpura，HSP），是儿童期血管疾病中，发病率最高的小血管炎性病变。现代医学目前认为其发病机制因身体对一些易敏物质做出异常的、过高的免疫应答，导致毛细血管发生变态反应，由于其脆性和通透性增加，导致血液从血管外渗，出现临床症状，如非血小板减少性皮肤出血点，关节肿痛，腹部疼痛，消化道出血，黑便，蛋白尿等1。该病在 7 14 岁的学龄前和学龄儿童中更常见，并且男孩比女孩发病更多。该病春秋两季发病率高于冬夏两季，且大多数患有 HSP的儿童发病前有呼吸道感染病史2。中国古代没有过敏性紫癜这一病名，根据症状将它归纳到中医血证、葡萄疫、紫癜风等范畴内。生地黄是双子叶植物玄参科植物地黄的块根3。地黄根茎中的化学成分以甙类为主，还含有-谷甾醇、地黄素、生物碱、氨基酸、糖类、有机酸，以及维生素 A 类物质和多种微量元素4-5。因其有效成分，生地黄能够滋阴泻热，凉血补血6，临床主治温病热入营血，热病后期阴虚火旺、发热口渴、阴伤肠燥便秘，血热呕血、鼻衄、尿血、黑便、崩漏下血、胎动不安等疾病。JAK2/STAT3 通路中，JAK2 和 STAT3 在 Th 细胞分化中起重要作用6。Th1 细胞产生 IFN-、IL-2 等细胞因子，可通过激活 T 细胞和吞噬细胞，诱导 Th0 细胞转化为 Th1 细胞和抑制 Th2 细胞来拮抗炎症。Th2细胞产生 IL-4、IL-10 等细胞因子，通过促进免疫球蛋白 E（IgE）的分泌和增加肥大细胞和嗜酸性粒细胞诱发炎症7。本文基于中草药生地黄清热滋阴养血的药物功效，将通过实验得到其提取物，进而研究生地黄提取物在淋巴系统中抑制抗体产生、抑制单核细胞和淋巴细胞浸润的病理变化，以及抑制急性炎症反应的机制，以探讨生地黄提取物治疗 HSP 的潜在作用机制。purpura(HSP)in mice.MethodsMethods Sixty SPF grade male experimental mice were randomly divided into a control group,a model group,a cimetidine group(0.1g/mL),and low-,medium-,and high-dose groups of unprocessed rehmannia root extract(10,20,30 mg/mL).Except for the mice in the control group,an HSP model was made in all the other mice.After that,they were treated by gavage with the corresponding experimental drugs of the same amount every day,while the model group and control group were gavaged with the same amount of normal saline,all for 21 consecutive days.At the end of the experiment,the pathological changes in renal tissue were measured by Schiffs iodate staining,and the serum levels of IFN-,IL-2,IL-4 and IL-10 were measured by ELISA kits.Western blot was used to detect the relative protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 in the mouse kidney tissue.ResultsResults The pathological scores were significantly lower in both the cimetidine group and the unprocessed rehmannia root extract groups than those in the model group,and the histological damage to the kidneys of the mice was significantly reduced after administration of the drugs.Compared with those in the control group,the expressions of IFN-and IL-2 were significantly decreased in the model group,while the expressions of IL-4 and IL-10 were significantly increased(P0.05);Compared with those in the model group,the levels of IFN-and IL-2 were increased in both the cimetidine group and the low-and high-dose groups of unprocessed rehmannia root extract,while the levels of IL-4 and IL-10 were decreased(P0.05),and compared with those in the low-and medium-dose groups of unprocessed rehmannia root extract,the corresponding expression levels decreased or increased more significantly in the high-dose group(P0.05).Compared with those in the control group,the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 in the kidney tissue of mice were significantly increased in the model group(P0.01),while the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 in the kidney tissue of mice were significantly lower in the high-dose group than those in the cimetidine group and the low-and medium-dose groups(P0.05).ConclusionConclusion The extract of unprocessed rehmannia root has a significant antioxidant activity and an anti-inflammatory effect,which can alleviate the symptoms in HSP mice.Its mechanism may be related to inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signaling pathway,thereby regulating the protein expression levels of p-JAK2 and p-STAT3.Keywords:Keywords:Henoch-Schnlein purpura;unprocessed rehmannia root;Janus Kinase 2(JAK2);signal transducer and activator of transcription 3(STAT3);renal injury1190 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 1 资料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 SPF 级 5 6 周龄雄性 ICR 小鼠 60只，体质量（25.02.5）g，由长春亿斯实验动物科技公司提供。控制饲养条件一致，允许小鼠自由进食与饮水，并将其在一个通风良好的饲养笼中饲养。1.1.2 仪器 Kimble 微量电动组织匀浆器（美国 Fluka 公司）；Multiskan GO 全波长酶标仪（美国 Thermo Fisher 公司）；Fresco 17 微量高速冷冻离心机（美国 Thermo 公司）；MULTIAKAN MK3 全自动酶标分析仪（美国 Thermo 公司）；ZCLIPSE 50i 型光学显微镜及图像分析系统（日本 Nikon 公司）；Powerpac Univeal 通用型电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；DFM-60D 倒置荧光显微镜（上海光学仪器厂）。1.1.3 药品试剂 生地黄干燥的块根；西咪替丁（哈药集团三精制药有限公司，国药准字：H230229）；麦胶蛋白（东京化成工业股份有限公司）；兔抗大鼠 NF-B p65 多克隆抗体（BA0610）（英国 Abcam 公司）；SV-0002 两步法免疫组化检测试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；p-JAK2、p-STAT3检测试剂盒（美国 Immunoway 公司）；ELISA 检测试剂盒（深圳达科为生物技术有限公司）。1.2 实验方法1.2.1 生地黄提取物的制备 将生地黄干燥的块根研磨成粉，准确称取 10.0 g，将生地黄粉置于索氏提取器中，以体积分数 70%乙醇为提取剂，在原料（g）溶液（mL）在1:20的条件下，回流2 h，提取2次，混合，进行过滤，并减压浓缩，得到乙醇提取物。再将其转移到分液漏斗中，加入 200 mL 蒸馏水，混合均匀制成悬浮液。然后依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每级重复3次，依次得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物。1.2.2 小鼠分组、模型构造与给药方法 将 60 只小鼠适应性喂养5 d后，按随机数字表法平均分成对照组、模型组、西咪替丁组、生地黄提取物低、中、高剂量组，每组各 10 只。除对照组小鼠外，其余小鼠造模 HSP，方法如下8，于小鼠尾部进行静脉注射40 mg/kg 印度墨汁 7 日 1 次，连续注射 21 d。采用尾静脉注射印度墨水结合麦胶蛋白灌胃建立 HSP 模型。将 0.1%麦胶蛋白溶于 6 mmol/L HCl酸化水，连续14周，每2日1次灌胃小鼠该溶液。在灌胃结束前3天，改为每日1次0.2 mL/20 g 的麦胶蛋白溶液，尾部静脉注射，而在模型组进行实验干预的相同时间，对照组尾部静脉注射接受相同量的 6 mmol/L HCl 酸化水。模型成功标准9：皮下出现紫癜，显微镜下可见局灶性上皮细胞增多和炎性细胞浸润，肾脏发生病理改变。成功后，小鼠按实验要求每日灌胃 1 次等量实验溶液，西咪替丁组灌胃 0.1 g/mL 西咪替丁溶液，生地黄提取物低、中、高剂量组灌胃给药体积依次为10 mg/mL、20 mg/mL 和 30 mg/mL 溶液，模型组和对照组灌胃生理盐水，连续 21 d。1.3 观察指标1.3.1 肾组织病理学检测 通过石蜡包埋将肾组织标本处理以制备成组织切片，之后进行过碘酸雪夫染色。从每组切片中随机选取 10 个肾小球和肾小管间质区，在高倍视野（400）下，根据系膜增生面积等表现进行病理学评分，并计算每组 10 个视野发生损害组织学评分的平均值。观察肾小球和肾小管间质病理改变。并将另一个肾脏组织置于液氮中，冻透后转入-80冰箱保存备用。1.3.2 血清 IFN-、IL-2、IL-4、IL-6 水平测定 小鼠麻醉后，注射针连续多次股动静脉取血，每只小鼠约3 mL，取其中 1 mL 血静置 15 30 min，3 000 r/min转速离心15 min，提取血清，贮存于4冰箱，避光保存。测定时移至常温解冻 30 min，参照 ELISA 试剂盒说明书分别检测各组小鼠血清中 IFN-、IL-2、IL-4、IL-10的水平。1.3.3 小鼠肾组织 p-JAK2、p-STAT3 相对蛋白的表达情况 取新鲜冻存肾脏组织 0.05 g 加入蛋白裂解液0.5 mL，用匀浆器在冰上将肾脏组织匀浆并在冰上裂解20 min 后于4 15 000 r/min离心15 min 收集上清液，考马斯蓝法测蛋白定量。定量提取到的蛋白后，在缓冲液中煮沸，使蛋白变性，取 20 g 上样，300 mA 横流转模 3 h，3%BSA 封闭 30 min，加入一抗 p-JAK2、p-STAT3，4 维持过夜。次日，3 min5 次 TBST 洗膜，加入 HRP 结合的二抗（1:10 000），室温下孵育 2 h，3 min6 次 TBST 洗膜。使用超敏型 ECL 化学发光底物试剂盒。使用 Total Lab Quant 凝胶定量分析软件，用于读取条带的IOD值。以-肌动蛋白（-actin）为内参物，Image软件分析并计算蛋白的相对表达水平。1.4 统计学方法 采用 SPSS 26.0 软件。计量数据采用均数 标准差（sx）表示；满足正态性及方差齐性的组间比较采用单因素方差分析；不满足正态性或方差齐性的组间比较采用 Kruskal Wallis 检验。组间差1191 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 异有统计学意义时，采用 Dunnett 法进一步两两比较。计数资料以百分率（%）表示，2 组之间比较采用 2或 Fisher 确切概率检验。检验水准 =0.05。2 结果2.1 各组小鼠肾脏组织病理学改变比较 如图 1。注：A.对照组；B.模型组；C.西咪替丁组；D.生地黄提取物高剂量组；E.生地黄提取物中剂量组；F.生地黄提取物低剂量组图 1 各组小鼠肾脏组织病理学改变比较2.2 各组小鼠血清中 IFN-、IL-2、IL-4、IL-10 水平比较 见表 1。2.3 各组小鼠肾组织 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达比较 见表 2 和图 2。3 讨论 HSP 的发生与外邪侵袭、饮食失调、血瘀、久病体弱等因素相关9。伏热在内，外感时邪，其主要病机为热入血分，迫血妄行，血不循经，而发为紫癜10。本病早期多为风热侵袭，损伤血络，血热妄行，以阳、热、实证为主要的症状。病之初多实，故初为实证；病久则由实转虚，因正虚而发病者均属虚证；或由于病情复杂，既有虚象又有实象，形成虚实夹杂证。与心、脾、肺三脏密切相关，也可涉及肝、肾11。根据紫癜的发病快慢、病程长短、颜色深浅等方面区分病情的虚和实12-13。发病迅速，病程短，紫癜鲜明色深的患者，多为实证。发病缓慢，病程长，紫癜病情反复，表 1 各组小鼠血清中 IFN-、IL-2、IL-4、IL-10 水平比较（sx，n=10）pg/mL组别IFN-IL-2IL-4IL-10对照组226.9332.4874.9214.36 68.7315.1652.8414.36模型组105.2120.65#39.188.06#242.4940.21#105.5221.58#西咪替丁组142.9725.61#45.239.04#186.7532.0489.7816.02#生地黄提取物高剂量组214.3731.03#70.2810.25#78.8615.42#56.8411.53#生地黄提取物中剂量组197.4228.34#52.169.74#124.3728.54#73.1613.82#生地黄提取物低剂量组145.3926.73#44.938.75#173.4231.65#87.4814.36#注：与对照组比较，#P 0.05，#P 0.01；与模型组比较，P 0.05；与西咪替丁组、生地黄提取物低、中剂量组比较，P 0.05表 2 各组小鼠肾组织 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达比较（xs，n=10）组别p-JAK2p-STAT3肾小球（%/小球）肾小管-间质/%肾小球/（%/小球）肾小管-间质/%对照组 1.310.52 2.210.590.260.08 0.910.68模型组13.542.03#30.767.82#0.320.26#16.251.47#西咪替丁组 8.931.36#14.622.16#0.280.17#10.251.26#生地黄提取物高剂量组 3.281.24#5.421.37#0.240.12#3.861.53#生地黄提取物中剂量组 5.051.32#9.571.92#0.260.16#7.941.25#生地黄提取物低剂量组 8.041.34#13.862.09#0.300.15#9.861.31#注：与对照组比较，#P 0.05，#P 0.01；与模型组比较，P 0.05；与西咪替丁组、生地黄提取物低、中剂量组比较，P 0.05 注：A.对照组；B.模型组；C.西咪替丁组；D.生地黄提取物高剂量组；E.生地黄提取物中剂量组；F.生地黄提取物低剂量组图 2 各组小鼠肾组织 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达比较颜色浅的患者，多为虚证。治疗原则以清热凉血、解毒化瘀为主14。如风热伤络者，宜祛风清热，凉血安络；湿热痹阻者，宜清热祛湿，活血通络15；胃肠积热者，宜泻火解毒，清胃除斑；热在血分者，宜清热解毒，凉血化瘀；恢复期气阴两虚者，多用益气养血，滋阴凉血之药，以恢复患者损害的气阴16。有学者17的经验治疗 HSP 常用犀角地黄汤随证加减，其方中以犀角（水牛角替）、生地黄、牡丹皮、赤芍为主要有效药物。其中作为基本药材之一的生地黄，以其清热凉血、养阴生津的功效见长。近年，国1192 2023 年 10 月第 43 卷第 10 期 Jilin Journal of Chinese Medicine Oct.2023 Vol.43 No.10 内和国际研究人员专注于寻找植物中可清除自由基的有效成分，对植物中各种活性成分（如酚类和黄酮类）的抗氧化和抗炎活性的研究也在增加。生地黄的提取物不但具有促止血的作用，还具有强心、利尿的作用，主要作用部位在于心肌18。地黄酒中生地黄与益母草同用，治疗血热崩漏或产后出血、心神不宁者。生地黄若与知母、地骨皮一起使用，可治虚烦内热以及糖尿病消渴症状，由于其强心、利尿的作用，使热从小便而出，利水道引热下行从而可达到清解热邪的作用，如益胃汤。JAK/STAT 信号通路是一条新近研究发现的细胞内主要信号传导机制途径。该通路可激活刺激机体细胞，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡和免疫调节，并与多种细胞因子和生长因子相关19。其中 JAKI/2 和TYK2 是一类独特的非受体型酪氨酸蛋白激酶，广泛存在于机体各种组织中，而特殊的 JAK3 仅存在于骨髓和淋巴系统内20。综上所述，生地黄提取物对 HSP 小鼠具有显著的抗氧化活性和抗炎作用，其治疗 HSP 可能是通过抑制JAK2/STAT3 途径的激活，来影响 p-JAK2 和 p-STAT3蛋白的表达情况，从而达到减轻小鼠HSP症状的目的。但研究尚存在不足，未设置通路激活剂组进行验证，且由于观察期较短，本研究未能进一步探讨其他客观指标对实验的影响，仍需要更长的随访期来进一步研究其对疾病的预后是否具有影响。参考文献：1CHEN X,YUE R C,LI X M,et al.Surfactant protein A modulates the activities of the JAK/STAT pathway in suppressing Th1 and Th17 polarization in murine OVA-induced allergic asthmaJ.Laboratory Investigation;a journal of technical methods and pathology,2021,20(6):78-79.2 杨云,马喜兴,王大虎,等.孟鲁司特对过敏性紫癜小鼠炎性因子的影响及其作用机制 J.中国免疫学杂志,2018,34(8):122-123.3 张维方,樊克锋,雷敬卫,等.地黄药材的红外指纹图谱及多元统计分析 J.光谱学与光谱分析,2021,41(11):3392-3398.4 常红,林毅,雷珂,等.SOCS 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