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2022届高考生物一轮复习 现代生物科技专题 第1讲 基因工程教案 新人教版选修3

2022届高考生物一轮复习 现代生物科技专题 第1讲 基因工程教案 新人教版选修3

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第1讲　基因工程
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3.基因工程的应用(Ⅱ)
4.蛋白质工程(Ⅰ)
1.基因的结构与功能(生命观念)
2.基因工程的操作流程图及蛋白质的流程图等(科学思维)
3.基因工程的应用和蛋白质工程(科学探究)
4.正确看待转基因生物与环境安全问题(社会责任)
考点一　基因工程的基本工具及基本程序

1．基因工程的概念
(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④作用结果
—
(2)DNA连接酶
种类
E·coli_DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
③运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
3．基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成

(3)将目的基因导入受体细胞
①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
(4)目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
个体水平
4.PCR技术
(1)原理：DNA复制。
(2)前提：已知目的基因的一段核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(3)条件：DNA模板、引物、热稳定DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
(4)扩增过程
过程
说明
图解
变性
温度上升到90～95 ℃左右，双链DNA解链为单链

复性
温度下降到55～60 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸
温度上升到70～75 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸

(5)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

1．限制酶的选择方法

图甲　　　　　　　　图乙
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
3．受体细胞的选择
受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，也没有核糖体等细胞器，不能合成蛋白质。

1．用基因工程生产乙肝疫苗时，若选用细菌为受体细胞，则不能得到引起免疫反应的基因表达产物，分析其原因。
提示：大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。

2．用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
提示：基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。
部分基因文库的构建过程：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。
3．现有一长度为1 000碱基对(bp)的DNA分子，用限制酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp；用KpnⅠ单独酶切，得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子片段；用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子片段。尝试绘出该DNA分子的酶切图谱。
提示：

考查基因工程的工具
1．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

图(a)

图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________
________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是________
________________________________________________________________。

甲　　　　 乙　 　　　丙
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
[解析]　(1)由题图可知，BamH Ⅰ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
[答案]　(1)Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　(2)甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可以)　(3)E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶(其他合理答案即可)
2．(2020·山东省高三二模)大肠杆菌β­半乳糖苷酶(Z酶)可催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质。在pUC18质粒中，lacZ′编码Z酶氨基端的一个片段(称为α­肽)，该质粒结构及限制酶识别位点如图甲所示。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性。利用图乙中的DNA片段与pUC18质粒进行基因工程操作。

甲　　　　　　　　　　　乙
(1)限制酶能催化双链DNA分子中____________(填化学键名称)的断裂。本实验可使用限制酶________处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段，再通过DNA连接酶连接，获得含目的基因的重组质粒。
(2)用重组质粒转化大肠杆菌，然后将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的固体培养基上进行培养，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有________，在该培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于________培养基。
(3)当上述培养基中含有X­gal时，生长出的菌落有蓝色和白色两种类型，其中含有重组质粒的大肠杆菌的菌落颜色为________，这是因为________________________________________。为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是_____________________。
[解析]　(1)限制酶能催化双链DNA分子中磷酸二酯键的断裂，将DNA降解。从图中可知，酶HindIII可破坏目的基因，而质粒和目的基因两侧都有酶SalⅠ识别位点，因此本实验可使用限制酶SalⅠ处理pUC18质粒和图乙中的DNA片段。(2)重组质粒上有氨苄青霉素抗性基因，由于未发生转化的大肠杆菌没有该质粒，因而不具有氨苄青霉素抗性，在含氨苄青霉素培养基上不能生长。从功能上划分，该培养基属于选择培养基，选择了含重组质粒的大肠杆菌。(3)从图中可知，重组质粒是用酶SalⅠ分别处理过的质粒和目的基因片段形成的，重组质粒的lacZ′基因被破坏，不能合成β­半乳糖苷酶(Z酶)，不能催化底物(X­gal)水解产生蓝色物质，故呈菌落白色。已知α­肽、缺失α­肽的Z酶片段单独存在时均无Z酶活性，共同存在时就会表现出Z酶活性，为保证能通过菌落颜色辨别出含有重组质粒的大肠杆菌，本实验作为受体细胞的大肠杆菌中Z酶基因应满足的条件是编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常。
[答案]　(1)磷酸二酯键　SalⅠ　(2)氨苄青霉素抗性　选择　(3)白色　目的基因与质粒连接后使lacZ′被破坏，不能合成α­肽　编码α­肽的DNA序列缺失，其他序列正常
基因工程的操作程序
3．(2020·湖北省高三一模)新型肺炎的病原体——新冠病毒，结构如图所示(棘突、脂质膜、包膜成分都是含有蛋白质，它们分别是由病毒RNA的基因S、M、E的指导合成)。根据相关知识回答下列问题：

(1)新冠病毒侵染过程中，棘突首先与细胞膜上受体结合，可能作为病毒的疫苗。如果利用基因工程研制新冠病毒疫苗，第一步是得到基因S，以用于后续操作，请简述获取S基因过程__________________________________。基因工程的核心步骤是______________，完成该步骤所需要的酶有____________。理论上，目的基因S应该导入________细胞中让其表达，以得到合适的产物。
(2)制备出来的“产品”必须具备________________________、________________________才能作为疫苗来使用。
(3)检测新型肺炎的一般策略是检测疑似病例是否携带新冠病毒。新冠病毒主要由核酸和蛋白质构成，如果检测核酸，一般的方法是________；如果检测其特异性蛋白，方法是____________。
[解析]　(1)由于新冠病毒的遗传物质是RNA，故应提取病毒的RNA，逆转录成对应DNA后，PCR技术扩增得到基因S(或对病毒基因S测序，然后人工合成基因S )。基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，完成该步骤所需要的酶有限制酶和DNA连接酶。理论上目的基因S应该导入受体细胞如哺乳动物(或大肠杆菌、哺乳动物)中让其表达，才能得到合适的蛋白质产物。(2)制备出来的“产品”不能对接受疫苗的生物有害，还应使其产生抗体，必须具备没有传染性和致病性(或没有“毒性”)、能引起对新冠病毒的特异性免疫才能作为疫苗来使用。(3)检测新型肺炎的一般策略是检测疑似病例是否携带新冠病毒，新冠病毒主要由核酸和蛋白质构成，如果检测其核酸RNA，RNA可由DNA转录而来，一般用探针法(或PCR法)；如果检测其表达的特异性蛋白，方法是抗原—抗体杂交。
[答案]　(1)提取病毒的RNA，逆转录成对应DNA后，PCR技术扩增得到基因S(或对病毒基因S测序，然后人工合成基因S)　基因表达载体的构建　限制酶和DNA连接酶　哺乳动物(或大肠杆菌、哺乳动物)　(2)没有传染性和致病性(或没有“毒性”)　能引起对新冠病毒的特异性免疫　(3)探针法(或PCR法)　抗原—抗体杂交
4．真核生物基因中通常含内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。研究发现绿色木霉合成并分泌的环氧化水解酶可降解黄曲霉素B1。现有含绿色木霉的菌液，为获得环氧化水解酶，研究小组进行以下两种尝试：
(1)方法一
①从含有绿色木霉的菌液中提取细胞的mRNA，在________酶的催化下，合成cDNA。
②以cDNA为模板，通过________技术大量扩增，获得目的基因。
③构建目的基因表达载体，导入大肠杆菌的体内。
④目的基因在大肠杆菌体内正常转录，但是翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性，需做进一步的处理加工，原因在于________________________。
(2)方法二
①提取绿色木霉的全部DNA，选用适当的________酶处理后，会获得一些小的DNA片段。
②选择一些合适的载体与获取的DNA片段构建基因表达载体。与从cDNA文库中获取目的基因构建表达载体所用载体相比，该载体组成不需要添加__________________成分。
③载体和这些DNA片段连接起来，导入受体菌的群体中储存。
④从这些受体菌的群体中筛选出含有目的基因的受体菌，分离出目的基因，将该目的基因和载体结合，通过________法导入大肠杆菌体内。
⑤该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于____________________________________________。
[解析]　(1)以mRNA合成cDNA的过程为逆转录。以已知的cDNA为模板扩增目的基因的过程称为PCR技术。绿色木霉为真核生物，合成并分泌的环氧化水解酶为分泌蛋白，而大肠杆菌为原核生物，细胞内无内质网和高尔基体，因此在其体内翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性。(2)由提取绿色木霉的全部DNA获取一些小的DNA片段需要用限制酶进行处理。从cDNA文库中获取目的基因中无启动子和终止子。将该目的基因导入大肠杆菌的方法为转化法。从基因组文库里分离出的该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于目的基因中存在内含子。
[答案]　(1)①逆转录　②PCR　④环氧化水解酶是分泌蛋白，需要内质网和高尔基体加工　(2)①限制　②启动子、终止子　④转化　⑤目的基因中存在内含子
考点二　基因工程的应用和蛋白质工程

1．植物基因工程
(1)培育抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)抗病转基因植物：使用最多的是病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因。
(3)抗逆转基因植物：抗逆基因有抗旱基因、抗除草剂基因等。
(4)利用转基因改良植物的品质：如提高玉米中某种氨基酸含量、延长番茄储存时间、培育新花色的矮牵牛等。
2．动物基因工程
(1)提高动物生长速度：将外源生长激素基因转入动物体内，可以提高生长速度。
(2)用于改善畜产品的品质：将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可以使转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。
(3)用转基因动物生产药物：将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，培育乳腺生物反应器。
(4)用转基因动物作器官移植的供体。
3．基因工程药品
(1)受体细胞：多为原核细胞。原因是其繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少。
(2)方式：利用基因工程培育“工程菌”来生产药品。
(3)成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
4．基因治疗
(1)概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。
(2)类型：体外基因治疗和体内基因治疗。
(3)实质：正常基因的表达掩盖病变基因的表达，达到治疗疾病的目的。
(4)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。
5．蛋白质工程
(1)概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
(2)流程图

写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(3)蛋白质工程与基因工程的比较
①区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
②联系
a．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
b．基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。

1．基因工程技术已成功应用于人类生产生活中的诸多方面，请从植物育种或人类疾病预防与治疗方面举一实例，并说明制备该转基因产品的基本技术流程。(限100字以内)
提示：实例一：转基因抗虫棉。从细菌中克隆BT蛋白基因，构建重组载体，导入棉花细胞后进行组织培养，经过对再生植株中目的基因的检测，获得转基因棉花。
示例二：基因工程胰岛素。克隆人的胰岛素基因，构建重组载体，转入大肠杆菌后，检查目的基因，筛选高产菌株并进行培养，生产胰岛素。

2．通过对Bt蛋白质三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，写出其实验设计思路。
提示：参照密码子表，找到合成该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。

基因工程的应用
1．(2020·江西省高三联考)胶原蛋白广泛应用于医学、化妆品、化工原料等领域，科研人员开展利用家蚕生产人胶原蛋白的研究。请回答下列问题：
(1)家蚕核型多角体病毒(BmNPV)专性寄生于鳞翅目昆虫，将人胶原蛋白基因与________重组后，构建________。体外克隆目的基因的方法是__________________________。
(2)BmNPV的p10基因是极强的启动子，将目的基因连接在p10基因的下游，目的是________________________________________。目的基因与p10基因连接时，断裂与连接的化学键都是____________。
(3)重组BmNPV感染家蚕幼虫后，在幼虫淋巴液中提取蛋白质，用____________的方法检测目的基因是否成功表达。相比于大肠杆菌，选择家蚕作为人胶原蛋白的生物反应器，其优点是__________。
[解析]　(1)因为BmNPV专性寄生于鳞翅目昆虫，故将目的基因与BmNPV基因重组，构建基因表达载体，更有利于将目的基因导入家蚕细胞。PCR是指在体外复制特定DNA片段，可在短时间内大量扩增目的基因。(2)启动子位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。将目的基因与运载体连接时，限制酶和DNA连接酶作用的都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质，可用抗原－抗体杂交的方法。大肠杆菌为原核细胞，家蚕为真核生物，家蚕细胞中的内质网和高尔基体会对人胶原蛋白进行加工，与人体内表达的蛋白质结构和功能更相似。
[答案]　(1)BmNPV基因　基因表达载体　PCR技术　 (2)使目的基因在p10基因的驱动下高效表达　磷酸二酯键　(3)抗原－抗体杂交　家蚕细胞中的内质网和高尔基体会对人胶原蛋白进行加工，使表达的胶原蛋白与人的胶原蛋白的结构和功能相似
2．(2020·临沂市高三二模)Cre/loxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。其原理是重组酶Cre能识别loxP位点(特定的DNA序列)，并使loxP位点间的基因序列被重组或删除。受此启发，科学家在检测抗虫基因成功导入烟草细胞后，尝试用Cre/loxP重组酶系统删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因，其技术过程如图2(其中■表示启动子)。

图1

图2
(1)通过基因改造获得抗虫烟草过程中，为大量获得抗虫基因，可选择图1中引物________(用图中罗马数字表示)组合进行PCR扩增；扩增时，为确保抗虫基因和表达载体充分连接，常在基因上、下游引物的________端添加不同的限制酶切位点，其目的是______________________________。
(2)loxP是一种含34个碱基对的小型DNA片段，由一个不对称的间隔区和两个反向重复序列组成。Cre酶能特异性地识别反向重复序列并于特定位置切开磷酸二酯键，类似于基因工程中的________酶，从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒的原理是________________。
(3)通常用________法把携带抗虫基因的重组质粒甲导入烟草细胞，经检测导入成功后，抗除草剂基因即失去用途，继续留在烟草体内可能会引发的生物环境安全问题是_____________________。
(4)经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开，得到图2右侧的两个环状DNA分子。由于______________，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。
[解析]　(1)PCR技术扩增目的基因过程中，引物与模板链的3′端结合，子链从5′端开始延伸，故要扩增抗虫基因应选择图1中引物Ⅱ、Ⅲ；为保证抗虫基因和表达载体的充分连接，PCR扩增时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加相应的酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制酶酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。(2)Cre酶能特异性地识别反向重复序列并在特定位置切开磷酸二酯键，其功能类似于基因工程中的限制酶(限制性核酸内切酶)；从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒相当于实现了基因间的重组，原理是基因重组。(3)将重组质粒导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法；抗除草剂基因属于外源基因，若继续留在烟草体内可能会转移到杂草中，造成基因污染。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终合成所需蛋白质。据图可知，质粒乙的抗除草剂基因前没有启动子(其中■表示启动子)，故抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。
[答案]　(1)Ⅱ、Ⅲ　5′　减少DNA自连，使抗虫基因能定向插入表达载体　(2)限制　基因重组　(3)农杆菌转化　抗除草剂基因可能会转移到杂草中，造成基因污染　(4)质粒乙的抗除草剂基因前没有启动子
蛋白质工程及应用
3．(2019·海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经__________________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是____________________________________________
________________________________________________________________。
[解析]　(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，T­DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T­DNA中，得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
[答案]　(1)mRNA　逆转录酶　PCR　(2)T­DNA　整合到叶肉细胞染色体DNA上　(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
真题体验| 感悟高考　淬炼考能
1．(2020·山东等级考)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是____________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了____________________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是______________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总 cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是____________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是____________________________。

[解析]　(1)限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
[答案]　(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录(或反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
2．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________
________________________________________________________________。
[解析]　(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案]　(1)基因组文库　cDNA文库　(2)解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键　(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
3．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
[解析]　(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。
[答案]　(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达　(2)转化　外壳蛋白(或噬菌体蛋白)　细菌　(3)蛋白酶缺陷型　蛋白酶
4．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1­GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析]　(1)据图示信息分析：将L1­GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1­GFP融合基因的完整，又能保证L1­GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核