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2022年-2023年上半年河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析.pdf
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1、第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2023070132022年2 0 2 3年上半年河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒的中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine遗传变异分析Vol.45,No.12Dec.2023顾文源1,2+,张帅2,赵云环,李思琪2,刘濮毓,范京惠2.3,左玉柱2 3(1.河北省动物疫病预防控制中心,河北石家庄0 50 0 53;2.河北农业大学动物医学院,河北保定0 7 10 0 1;3.河北省兽医生物技术创新中心,河北保定0 7 10 0 1)
2、摘要:为了解当前河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行及流行株的遗传变异情况,本研究利用荧光定量PCR方法对2 0 2 2 年2 0 2 3年上半年于河北省不同规模养猪场采集的2 2 9 份疑似PRRSV感染猪的组织病料样品进行检测,结果显示,PRRSV阳性率为17.9%(41/2 2 9)。对鉴定的15株PRRSVORF5基因进行测序、遗传进化分析、以及潜在的N-糖基化位点分析。结果显示,15株PRRSVORF5基因序列的同源性为8 1.8%99.8%,氨基酸序列的同源性为8 1.1%10 0.0%;15株PRRSV均属于PRRSV-2型,其中的10 株属于谱系1(Lineage1
3、),1株属于Lineage5,4株属于Lineage 8;属于Lineage5的HB-HD-2株为一株类RespPRRSMLV疫苗株。部分病毒株的GP5蛋白氨基酸序列毒力相关位点出现R1Q、R15I、R15i K 突变,属于Lineage1的10 株PRRSVGP5蛋白在诱骗表位出现V27A和V29A突变,在其它中和表位区及高变区也出现了不同程度的变异;糖基化位点分析结果显示,GP5蛋白在aa44a a 46、a a 51a a 53位N-糖基化位点相对保守,在aa30a a 32、a a 33a a 35、a a 34a a 36 和aa57a a 59发生了不同程度的突变。以上结果表明,当
4、前河北省PRRSV流行株复杂多样,Lineage1PRRSV(NADC30-Like、NADC34-Like)正成为优势病毒株,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防控形势仍较为严峻。本研究为掌握当前河北省PRRSV的遗传变异情况,以及PRRS疫苗开发和防控提供了新数据和信息。关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;遗传进化分析;N-糖基化位点;GP5蛋白中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 8 7-0 8Genetic diversity and phylogenetic analysis of PRRSV in HebeiProvinc
5、e from 2022 to the first half of 2023GU Wen-yuan-2,ZHANG Shuai2t,ZHAO Yun-huan,LI Si-qi?,LIU Pu-yu,FAN Jing-hui2,ZUO Yu-zhu2.3*(1.Hebei Center for Animal Disease Prevention and Control,Shijiazhuang 050053,China;2.College of Veterinary Medicine,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;3.Heb
6、ei Veterinary Biotechnology Innovation Center,Baoding 071001,China)Abstract:To understand the current epidemic situation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)andthe genetic variation of the circulating strain in Hebei Province,229 tissue samples from pigs with suspected PRRSV
7、 infection*Corresponding author;+Equal contributors收稿日期:2 0 2 3-0 7-17基金项目:河北省省级科技计划资助项目(2 132 6 6 11D);河北省农业产业技术体系生猪创新团队(HBCT2023170201、HBCT2023170401);石家庄市科技计划项目(2 2 950 0 2 32 N)十共同第一作者:顾文源(1992-),女,江苏镇江人,博士,高级兽医师,主要从事动物疫病防控研究;张帅(1998-),男,河北永清人,博士研究生,主要从事动物传染病研究。*通信作者:E-mail:j i n g h u i 7 6 16
8、3.c o m;z u o y u z h u 16 3.c o m1288中国预防兽医学报2023年symptoms were collected from farms with different sizes in Hebei Province from 2022 to the first half of 2023.PRRSV wasdetected by real-time fluorescence-based quantitative PCR.Results showed that 41 of 229 materials were PRRSV-positive,with apositi
9、ve rate of 17.9%.The sequence,genetic evolution,and potential N-glycosylation sites of the ORF5 gene from 15 isolatedstrains were analyzed.Results showed that the nucleotide and amino acid sequence homology of 15 obtained PRRSV ORF5 geneswere 81.8%to 99.8%and 81.1%to 100.0%,respectively.All the 15 P
10、RRSV belonged to PRRSV-2,of which 10 strains belongedto Lineage 1,1 strain in Lineage 5,and 4 strains in Lineage 8;the HB-HD-2 strain,which belonged to Lineage 5 was a RespPRRS MLV-like vaccine strain.Virulence-related sites in GP5 amino acid in the some of the isolated strains showed RI3Q,Ri5I,and
11、Ri5K mutations,and 10 strains that belonged to Lineage 1 showed V27A and V29A mutations at the decoy epitope.Differentdegrees of gene variation also appeared in other neutral epitope regions and hypervariable regions.The N-glycosylation sites ofGP5 at aa44-aa46 and aa51-aa53 were relatively conserve
12、d,however,there are mutations at aa30-aa32,aa33-aa35,aa34-aa36,andaa57-aa59.These results indicated that the current epidemic strains of PRRSV in Hebei Province were complex and diversified.Lineage 1 PRRSV(NADC30-Like,NADC34-Like)began to be a prevalent Lineage.Better prevention and control measures
13、 forporcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)were urgently needed.Results of this study enriched the epidemiologicaldata and current genetic variation on PRRSV in Hebei Province.It provided new reference for the development of new vaccinesand for the prevention and control of PRRS.Key word
14、s:porcine reproductive and respiratory syndrome virus;genetic evolution analysis;N-glycosylation site;GP5protein猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种以母猪流产、产死胎和木乃伊胎等繁殖障碍及各阶段猪呼吸道症状为特征的传染病1-2 。因PRRSV感染猪后主要侵袭其免疫细胞,造成免疫抑制从而继发其它病原感染,给全球养猪业造成了严重的经济损
15、失3-4。根据病毒抗原性及基因型等差异,PRRSV可分为欧洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2),PRRSV-2 又可分为谱系(Lineage)19,当前我国主要流行PRRSV-2。郭宝清等于19 9 6 年首次分离到PRRSV,并命名为CH-la株5,近年来我国又相继出现了高致病性PRRSV(HP-PRRSV)、Q YYZ-l i k e、NA D C30-l i k e 及NADC34-like株。此外,还存在弱毒疫苗毒力返强、猪场不同类型病毒株重组,使我国PRRSV流行株变得越来越复杂6-12 ,PRRS防控难度加大。因此,需加强对PRRSV的流行及遗传变异情况的持续监测,为P
16、RRS的有效防控以及疫苗研发提供科学依据。PRRSV是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒,直径为50 nm7 2 mm,全基因组长约15kb13,基因组编码多种蛋白,非结构蛋白NSPl、NSPI、NSP2NSP12 由ORF1a和ORF1b编码,参与PRRSV的复制与基因组转录1415;结构蛋白GP2a、E、G P3、GP4、G P5、O RF5a、基质蛋白M和核衣壳蛋白N分别由ORF2a、O RF2 b、O RF3、O RF4、O RF5、O RF5a、ORF6和ORF7编码16 17 。其中GP5蛋白是PRRSV的主要结构蛋白,也是变异最多的糖基化囊膜蛋白,含多个N-糖基化位点;作为最主要的
17、保护性抗原,GP5包含多个B细胞表位和T细胞表位,可诱导机体产生中和抗体;同时GP5蛋白参与病毒的免疫逃逸、细胞凋亡等,其胞外结构域的诱骗表位和中和抗原表位周围的糖基化位点可通过屏蔽效应和空间位阻效应降低中和抗体对病毒的识别度,以减弱中和抗原表位的功能性,有利于病毒的侵入和免疫逃逸18 ,在PRRSV感染与侵入中发挥重要作用,由于ORF5基因的高变异特性,目前已被广泛用于PRRSV的遗传进化分析和分子流行病学调查研究192 1。本研究对2 0 2 2 年2 0 2 3年上半年收集自河北省不同地区规模化猪场的疑似PRRSV感染猪临床样品检测,并对检测到的PRRSVORF5基因经扩增并测序、遗传进
18、化和氨基酸序列、N-糖基化位点分析,为河北省PRRSV的分子流行病学研究提供数据支持,为研制和选择有效安全的PRRS疫苗提供参考。1材料与方法1.1主要实验材料2 0 2 2 年2 0 2 3年上半年(1月6月),从河北省(包括保定、石家庄、张家口、沧第12 期顾文源,等.2 0 2 2 年2 0 2 3年上半年河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析1289州、衡水、承德、邯郸等地)不同规模养猪场采集有呼吸道症状的病死仔猪脾脏、肺脏、淋巴结等病料样品,共采集2 2 9份。反转录试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司;DNA/RNA核酸提取及纯化试剂盒购自湖南冠牧生物科技有限公司;DNA纯化试
19、剂盒购自杭州倍沃医学科技有限公司;FastTaqManMixture、T a q M a s t e r M ix 购自北京康为世纪生物科技有限公司;DL2000 DNAMarker购自TaKaRa公司。1.2引物的设计与合成根据GenBank中PRRSV经典株CH-1a(AY032626)、H P-PRRSV JXA 1株(EF112445)和NADC30株(JN654459)的ORF5基因保守序列,利用SnapGene软件设计ORF5基因扩增引物ORF5F/R:5-GGTCCCAAGTTTTAGCTCGTC-3/5-AGCCGCCATTAGCACGCTCTG-3,预期扩增的基因片段为7 1
20、0 bp(含引物序列),引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3样品处理与核酸提取对采集的疑似PRRSV感染的临床样品(脾脏、肺脏、淋巴结等脏器组织)利用研磨器研磨后48 0 0 0 r/min离心10 min取上清,置于-2 0 备用。利用DNA/RNA核酸提取及纯化试剂盒提取样品上清中的核酸,经反转录试剂盒反转录为cDNA,置-8 0 备用。1.4临床样品的检测与PRRSV ORF5基因的PCR扩增利用本实验室前期建立的PRRSV通用型荧光定量PCR(q PCR)方法4 对1.3中的2 2 9份cDNA进行检测,Ct35时判为阳性,Ct35时判为阴性。并从不同地市的不同PRRSV
21、阳性猪场中,选择Ct值较低(Ct25)的样品,利用ORF5基因扩增引物ORF5F/R进行PCR扩增,扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.5PRRSVORF5基因的同源性及遗传进化分析对测序获得的PRRSV ORF5基因序列以及选自NCBIGenBank中PRRSV各个谱系代表性病毒株的ORF5基因序列,利用Megalign软件分析其ORF5基因编码的氨基酸序列的同源性,采用MEGA7软件构建ORF5的系统进化树,分析其遗传进化类系。1.6PRRSVGP5蛋白氨基酸序列分析根据本研究获得的15株PRRSVORF5核苷酸序列推导氨基酸序列,利用Megalig
22、n软件对15株PRRSV和参考株进行GP5蛋白氨基酸序列比对和分析。1.7PRRSVGP5蛋白N-糖基化位点分析利用Netnglyc1.0 server在线软件分析获得的15株PRRSVGP5蛋白氨基酸序列及参考株序列的N-糖基化位点。2结果与讨论2.1临床样品检测与PRRSVORF5基因的PCR扩增结果利用本实验室建立的通用型qPCR方法4 对反转录获得的2 2 9份cDNA进行PRRSV检测,结果显示,PRRSV阳性率为17.9%(41/2 99)。从41份阳性样品中,选择来自不同地区和不同猪场中Ct值较低(Ct值范围在2 1.132 4.18)的样品15份,利用ORF5基因扩增引物ORF
23、5F/R进行扩增,对与预期大小相符的扩增条带经DNA纯化试剂盒纯化后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序结果显示,获得15条均为7 10 bp的基因序列,包含6 0 3bp的ORF5基因序列,与预期相符。PRRSV为危害我国养猪业的重要病原之一,掌握其在河北省的最新流行情况,是对河北省PRRS有效防控的前提。梁俊超等对2 0 2 0 年我国山东、河北、江苏、安徽等7 个省PRRSV分子流行病学调查结果显示,送检样品中PRRSV阳性率为2 3.6 8%(135/57 0)2 。张晨对2 0 2 1年我国2 4个省、市、自治区发病猪场的PRRSV调查结果显示,不同地区PRRSV的阳性率为1
24、9.58%41.41%,其中河北省的阳性率为2 1.17%(47/222)23。Zh a i 等对湖南和河北省2 0 2 1年PRRSV的流行病学调查结果显示,2 0 2 1年河北省PRRSV阳性率为2 7.8 2%(153/550)2 4,王福厚等对河北省2 0 2 2 年上半年PRRSV流行病学调查结果显示,PRRSV的阳性率为18.4%2 5,这与本研究对河北省2 0 2 2 年2 0 2 3上半年不同地市的阳性率(17.9%)相当。以上研究结果均表明PRRSV仍是危害河北省生猪健康的重要病原,对其流行及变异情况的监测工作仍需加强。2.2PRRSV ORF5基因遗传进化分析为了解本研究鉴
25、定的15株流行株遗传演化关系,利用Me-galign软件对本研究获得的15条ORF5基因序列进行核苷酸序列同源性比较和分析,结果显示,获得的15株PRRSVORF5之间核苷酸序列同源性为8 1.8%99.8%,与美洲型经典株VR-2332ORF5核苷酸序列同源性为8 4.6%99.3%,其中HB-HD-2与VR-2332株核苷酸序列同源性最高达99.3%,显示具有较近的亲缘关系;与疫苗株RespPRRS MLV核苷酸序列同源性为8 4.2%99.7%,其中HB-HD-2与RespPRRSMLV疫苗株核苷酸序列同源性最高达99.7%;1290中国预防兽医学报2023年与中国经典株CH-1a核苷酸
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