5种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45,No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.2022110095种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究赵桂新,付祥,王凤杰,刘万,张志强,张艳英,史秋梅*,吴同垒*(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室,河北 秦皇岛 066004)摘要:为筛选抗牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的中药,本研究选取大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连,测定其对MDBK细胞的最大安全浓度,在此基
2、础上通过计算各药物对病毒的抑制率分析上述中药对IBRV的直接杀伤作用、对IBRV黏附细胞的阻断作用和对IBRV在细胞内的抑制作用,确定上述中药对IBRV的有效抑制率;进一步,利用qPCR方法检测中药与IBRV作用后对MDBK细胞中细胞因子转录水平的影响。结果显示,连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草对MDBK细胞的最大药物安全浓度分别是3.125 mg/mL、3.125 mg/mL、0.780 mg/mL、1.560 mg/mL和0.780 mg/mL;大青叶对IBRV的直接杀伤作用最好,金银花对IBRV黏附细胞的阻断作用和对细胞内IBRV复制的抑制作用最好;鱼腥草可显著提高细胞中TNF-琢、I
3、L-2和IFN-酌的转录水平(0.001);大青叶可极显著提高细胞中IL-1茁、IL-2、IL-4、TNF-琢和IFN-酌的转录水平(0.001);黄连可极显著提高细胞中IL-1茁的转录水平(0.001)。结果表明连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草均有抗IBRV作用,其抗病毒方式并不相同,本研究为抗IBRV中药的研发奠定基础。关键词:中药;牛传染性鼻气管炎病毒;细胞因子中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)08-0846-07Study on the mode of action of five Chinese herbal medicinesagai
4、nst bovine infectious rhinotracheitis virusZHAO Gui-xin,FU Xiang,WANG Feng-jie,LIU Wan,ZHANG Zhi-qiang,ZHANG Yan-ying,SHI Qiu-mei*,WU Tong-lei*(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hebei Province,Hebei Normal University of Science&Technology,Qinhuangdao 066004,China)Abstract:In order
5、to analyze the anti-bovine infectious rhinotracheitis virus(IBRV)effect of the aqueous extract of Chineseherbal medicine,five Chinese herbal medicines,Da Qing Ye,Jin Yin Hua,Yu Xing Cao,Lian Qiao and Huang Lian,wereselected to determine the maximum safe concentration on MDBK cells,the direct killing
6、 effect of these drugs on IBRV,theblocking effect on IBRV adhesion cells and the inhibiting effect on IBRV replication.Cell viability was detected by CCK-8 kit,and the effective inhibition rate of different concentrations of drugs on IBRV was obtained.Further,the effect of Chinese medicineand IBRV o
7、n the transcription level of cytokines after acting in MDBK cells was analyzed by qPCR method.The results showedthat the maximum drug safe concentrations of Lian Qiao,Jin Yin Hua,Huang Lian,Da Qing Ye and Yu Xing Cao were3.125mg/mL,3.125mg/mL,0.780mg/mL,1.560mg/mL and 0.780mg/mL on MDBK cells,respec
8、tively.Da Qing Ye had the best收稿日期:2022-11-06基金项目:国家自然科学基金(31902310);河北省农业厅现代农业产业技术体系肉牛疫病防控岗位专家项目(2018NYTRN-1);河北省重点研发计划(19226628D)作者简介:赵桂新(1995-),女,河北沧州人,硕士研究生,主要从事微生物学方向研究.*通信作者:E-mail:;*Corresponding authordirect killing effect on IBRV,Jin Yin Hua had the best blocking effect on IBRV adhesion cel
9、ls and the best inhibiting effect onIBRV replication;Yu Xing Cao significantly increased the transcription level of cellular TNF-琢,IL-2 and IFN-酌(0.001);DaQing Ye significantly increased the transcription level of cellular IL-1茁,IL-2,IL-4,TNF-琢 and IFN-酌(0.001);Huang Liansignificantly increased the
10、transcription level of cellular IL-1茁(0.001),these cytokines play important roles in the antiviral effect.The results showed that all the five herbal medicines above were safe for MDBK cells,and that Lian Qiao,Jin Yin Hua,HuangLian,Da Qing Ye and Yu Xing Cao had different degrees of anti-IBRV effect
11、s,which laid a foundation for the development ofanti-IBRV herbal medicines.Key words:traditional Chinese medicine;bovine infectious rhinotracheitis virus;cytokines牛 传 染 性 鼻 气 管 炎(Infectious bovine rhinotra-cheitis,IBR),又称“红鼻病”,是由牛疱疹病毒1型(BoHV-1)引起的一种急性热性接触性传染的病毒性传染病1,感染后的主要临床表现为呼吸道症状、发热、呼吸困难和粘膜炎等2-3,
12、可导致牛生长缓慢、产奶量减少,还可致孕牛流产,感染牛终身带毒排毒4,并引起免疫抑制,可引发多种病原的混合感染。Madin等在1956年首次分离出病毒并被命名为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotra-cheitis virus,IBRV),1964年有学者确认牛鼻气管炎病毒属于疱疹病毒,严重威胁全球养牛业5。世界动物卫生组织(WOAH)已经将IBRV列为必须上报的动物传染病原之一,我国将IBR列为二类动物传染病6-7。目前,我国规模化养牛业迅速发展,为IBR的流行与传播创造了条件,感染率相对较高8。该病的暴发已呈高度蔓延趋势,严重危害我国养牛业发展。中药可以调
13、节畜禽免疫功能,具有抗细菌、抗毒素的作用,不易产生耐药性且毒性小。研究表明,紫玉米的叶、皮和芯中的天然色素-紫玉米花色苷具有良好的抗IBRV的作用9;毛茛树树皮粗提物以及水和乙酸乙酯馏分对病原具有很高的杀伤力和抑制疱疹病毒吸附的能力10;绣线菊提取物在体外以剂量依赖性方式显著抑制牛疱疹病毒1型(Bo-HV-1)的复制11;紫苜蓿提取物能显著抑制MDBK细胞中的BoHV-1复制12。中药在病毒感染方面有良好的潜在应用价值,筛选抗IBRV药物对防治IBR具有重要意义。本研究选用大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连,分析其体外抗IBRV的效果,并初步分析这些中药的抗病毒机制,为抗IBRV感染的中药研发
14、奠定了基础。1材料与方法1.1主要实验材料IBRV临床分离株(TCID50为10-4.46/0.1 mL)和MDBK细胞由河北省预防兽医学重点实验室保存;大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连购自石家庄中医院。1.2主要试剂高糖DMEM培养液、胎牛血清和0.25%胰酶均购自GIBCO公司;利巴韦林和CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;荧光定量PCR试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司;细菌RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。1.3引物的设计与合成根据GenBank中已登录的序列,设计IL-1茁、TNF-琢、IFN-酌、IL-4、IL-2、IL-6和茁-actin基因用于荧
15、光定量PCR(qPCR)扩增的引物,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物信息见表1。1.4中药提取液的制备在洁净烧杯中加入中药10 g,并加入100 mL去离子水浸泡1 h;将其放入砂表 1引物信息引物名称Primer nameIL-1茁-FIL-1茁-RIL-2-FIL-2-RIL-4-FIL-4-RIFN-酌-FIFN-酌-RTNF-琢-FTNF-琢-RIL-6-FIL-6-R茁-actin-F茁-actin-R引物序列(5-3)Primer sequences(5-3)TGACCCTAAACAGATGAAGAGCTCACGATGACCGACACCACCACCTCAACTCCTG
16、CCACAATTCCAGCAGCAATGACTTCACGTGTGATATTACCTTAGCACTTCTCAGTTGTGTTCTTATTCAAATTCCGGTGGATGATTCTCTTCCGGCTTTCTGAGGTAACAAGCCGGTAGCCCACGTCTTGATGGCAGACAGGATGGGGAAATCAGGAAAATGTTTCTCCAGCAGGTCAGTGTTCCAAGGCCAACCGTGAGAAGATCCACGTTCCGTGAGGATCTTCA赵桂新,等.5 种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究第 8 期847锅中大火煮至沸后用文火(70)煎煮30 min,滤出药液后再向砂锅中
17、加30 mL去离子水,继续用文火煎煮30 min,滤出滤液;将两次滤液混匀后6 000 r/min离心10 min,取上清液继续煎煮浓缩至10 mL,使中药提取液终浓度为1 g/mL,高压灭菌后用0.22 滋m滤膜过滤,-20 保存备用。1.5药物对MDBK细胞最大安全浓度的测定当96孔细胞培养板中MDBK细胞长成单层时,弃原液后用PBS缓冲液洗2次,将浓度为1 g/mL的中药液稀释5倍至200 mg/mL,该浓度下药液记为原液(下同),将原液和DMEM培养液按1颐1比例混匀,进行2倍倍比稀释,将5种中药和利巴韦林的稀释液(2 mg/mL、0.2 mg/mL、0.02 mg/mL、0.002
18、mg/mL)分别加入96孔板中,每孔100 滋L,各稀释度重复8次,于37 5%CO2培养48 h,每天观察细胞的形态变化及生长状况。48 h后用倒置显微镜观察并记录细胞病变情况,其中细胞病变等级可分为4个:“+”代表少量细胞由长梭形皱缩变圆后脱落;“+”代表半数以下细胞皱缩变圆后脱落,出现轻微的蚀斑现象;“+”代表大多数细胞皱缩变圆后脱落,聚集成葡萄串状,在单层细胞上出现较为严重的蚀斑现象;“+”代表几乎所有细胞均皱缩变圆并脱落,聚集成葡萄串样,在单层细胞上形成严重的蚀斑现象。利用CCK-8法测定细胞病变率,用PBS洗96孔板,根据CCK-8试剂盒操作方法向96孔板每孔加入10 滋L CCK
19、-8试剂后将其置于37 5%CO2继续培养4 h,测定每孔细胞OD450nm值,计算细胞病变率,并将细胞病变程度为“+”且细胞病变率最低时的药物浓度判定为药物最大安全浓度,可排除药物本身的毒性作用对细胞的损伤。细胞病变率(%)=(细胞对照组平均OD450nm值-试验加药组平均OD450nm值)/细胞对照组平均OD450nm值伊100%。1.6中药和利巴韦林在不同作用方式下抗IBRV的效果当MDBK细胞密度为70%80%时,选取利巴韦林作为对照,以中药和利巴韦林最大安全浓度为初始浓度2倍倍比稀释(2125),下同。将各个浓度的药物加入等量的100TCID50IBRV病毒液中,轻轻混匀后置于37
20、5%CO2培养4 h;以只加病毒原液不加药物的细胞为病毒对照组。取各混合液100 滋L加入96孔细胞板中,记为试验加药组,并设置不加任何药物的细胞对照组,37 孵育2 h,用PBS洗去未吸附的病毒和残余药物,置于温箱中继续培养,每12 h观察并记录细胞病变(CPE)情况。孵育72 h后,用PBS洗96孔板,根据CCK-8试剂盒操作方法向96孔板每孔加入10 滋L CCK-8试剂后将其置于在37 5%CO2继续培养4 h,测定每孔细胞OD450nm值,计算直接杀伤作用下不同浓度药物对IBRV的有效抑制率。药物对病毒的有效抑制率(%)=(试验加药组平均OD450nm值-病毒对照组OD450nm值)
21、/(细胞对照组平均OD450nm值-病毒对照组OD450nm值)伊100%。当96孔细胞板中的MDBK细胞密度为70%80%时,向各个孔中分别加入100 滋L最大安全浓度及2125稀释的各个药物,置于37 5%CO2中孵育4 h,用PBS缓冲液洗板,再向每孔接种100 滋L的100TCID50IBRV病毒液后继续孵育2 h,用PBS缓冲液洗去未吸附病毒,置于温箱中继续培养,每12 h观察并记录CPE情况。孵育72 h后,用PBS洗涤96孔板,方法同1.6.1测定每孔细胞OD450nm值,计算药物对IBRV的有效抑制率。当MDBK细胞密度为70%80%时,向各个孔中加入100 滋L100TCID
22、50病毒液,置于37 5%CO2孵育2 h,用PBS缓冲液洗板,再向每孔中加100 滋L的各个药物浓度梯度稀释液,继续在37 5%CO2培养箱中孵育2 h,用PBS缓冲液洗去残余药物,置于温箱中继续培养,每12 h观察并记录CPE情况。孵育72 h后,用PBS洗96孔板,方法同1.6.1测定每孔细胞OD450nm值,计算药物对IBRV的有效抑制率。1.7药物作用后MDBK细胞中细胞因子转录水平的qPCR检测当6孔细胞培养板中MDBK细胞密度为70%80%时,用PBS缓冲液洗板。预先将药物由最大安全浓度作为初始浓度10倍倍比稀释,稀释度为100102。在细胞对照组孔中加入2 mL 2%胎牛血清D
23、MEM培养液,病毒组孔中加入1 mL 2%胎牛血清DMEM培养液和1 mL病毒液,试验组孔中加入1 mL2%胎牛血清DMEM培养液和1 mL不同浓度的药物与100TCID50IBRV病毒的混合液。在37 恒温箱中培养12 h,吸弃培养液,用细菌RNA快速提取试剂盒提取试验组、细胞对照组和病毒组细胞的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用SYBR法qPCR测定IL-1茁、TNF-琢、IFN-酌、IL-4、IL-2和IL-6的转录中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年848水平。荧光定量PCR反应体系为25 滋L:SYBR 12.5 滋L、引物各0.5 滋L、cDNA模板1 滋L、ddH2O
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- 中药 体外 传染性 气管炎 病毒 作用 方式 研究
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