基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响.pdf
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1、浙江大学学报(农业与生命科学版)49(4):566 577,2023Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)http:/ 舟山 316022;2.浙江省海洋水产研究所,浙江 舟山 316021;3.浙江省海水增养殖重点实验室,浙江 舟山 316021)摘要 为研究大黄鱼(Larimichthys crocea)蛋白质在海水流化冰辅助保鲜期内的变化,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)技术定量标记新鲜(贮藏0 d)大黄鱼及不同海水流化冰贮藏时间(7、23 d)下大黄鱼的肌肉蛋白质,筛选出不同贮藏时间下的差异表达蛋白,并
2、对差异蛋白进行基因本体(gene ontology,GO)、直系同源簇/真核生物直系同源簇(clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups,COG/KOG)与京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。结果显示,在3个比较组(7 d vs 0 d、23 d vs 7 d和23 d vs 0 d)中鉴定到的差异蛋白总数分别为215、133、269个,其中表达上调的差异蛋白数分别为117、37、113个,表达下调的差异蛋白数分
3、别为98、96、156个。同时,3个比较组的共有差异蛋白为44个。GO分析表明,差异蛋白主要参与细胞过程、生物调节、细胞和细胞内组分、结合功能和催化活性等方面;COG/KOG分析表明,差异蛋白的功能活性主要集中在细胞骨架、碳水化合物转运和代谢、信号转导机制以及翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白等方面;KEGG分析表明,差异蛋白共参与38条信号通路,且在贮藏后期(23 d),紧密连接和致病性大肠埃希菌感染2条信号通路中差异蛋白的参与数目最多,它们可能是造成大黄鱼新鲜度急剧下降的主要信号通路。44个共有差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标进行的相关性分析表明,脆性X智力低下综合征相关蛋白2、肌醇-1-单磷酸酶
4、、Rho GDP解离抑制剂1、锚蛋白-1和甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白可以作为新鲜度指示蛋白。本研究为揭示大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的品质变化机制、大黄鱼新鲜度评价和保鲜工艺改进提供了依据。关键词 流化冰;大黄鱼;串联质谱标签;差异蛋白;新鲜度指示蛋白中图分类号 S984.1 文献标志码 A引用格式 赵月涵,梅光明,张小军,等.基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响J.浙江大学学报(农业与生命科学版),2023,49(4):566-577.DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.211ZHAO Yuehan,MEI Gua
5、ngming,ZHANG Xiaojun,et al.Tandem mass tag-based proteomics technology analyzing the effects of seawater slurry ice-assisted preservation on muscle proteins of Larimichthys croceaJ.Journal of Zhejiang University(Agriculture&Life Sciences),2023,49(4):566-577.Tandem mass tag-based proteomics technolog
6、y analyzing the effects of seawater slurry ice-assisted preservation on muscle proteins of Larimichthys croceaZHAO Yuehan1,2,3,MEI Guangming2,3*,ZHANG Xiaojun2,3,XU Dan2,3,ZHENG Bin1,DENG Shanggui1 DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2022.10.211基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项(2020YFD0900900)。通信作者(Corresponding
7、 author):梅光明(https:/orcid.org/0000-0002-9267-8112),E-mail:第一作者(First author):赵月涵(https:/orcid.org/0000-0002-1504-1070),E-mail:收稿日期(Received):2022-10-21;接受日期(Accepted):2023-01-10第 4 期赵月涵,等:基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响(1.College of Food Science and Pharmacy,Zhejiang Ocean University,Zhousha
8、n 316022,Zhejiang,China;2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute,Zhoushan 316021,Zhejiang,China;3.Key Lab of Mariculture&Enhancement of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,Zhejiang,China)Abstract In order to study the changes in muscle proteins of Larimichthys crocea during the seawater slurry i
9、ce-assisted preservation period,tandem mass tag(TMT)-based proteomics technology was used to quantitatively analyze the muscle proteins of fresh(stored for 0 d)L.crocea and the samples preserved by seawater slurry ice for different storage times(7 and 23 d).The differential proteins under different
10、storage times were screened out,and they were analyzed by gene ontology(GO),clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups(COG/KOG),and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG).The results showed that the total number of differential proteins identified in the three co
11、mparison groups(7 d vs 0 d,23 d vs 7 d,and 23 d vs 0 d)was 215,133 and 269,respectively.The number of up-regulated differential proteins was 117,37 and 113,respectively,and the number of down-regulated differential proteins was 98,96 and 156,respectively.At the same time,a total of 44 common differe
12、ntial proteins were identified in the three comparison groups.GO analysis showed that the differential proteins were mainly involved in cellular process,biological regulation,cell and intracellular components,binding function,and catalytic activity.COG/KOG analysis showed that the functional activit
13、ies of differential proteins were mainly concentrated in cytoskeleton,carbohydrate transport and metabolism,signal transduction mechanisms and posttranslational modification,protein turnover,and chaperones.KEGG analysis showed that 38 signaling pathways were involved and the number of differential p
14、roteins involved in the two signaling pathways of tight junction and pathogenic Escherichia coli infection was the highest at the late storage(23 d),which might be the main metabolic pathways causing the sharp decline in the freshness of L.crocea.The correlation analysis between 44 common differenti
15、al proteins with the freshness indexes of L.crocea showed that five freshness indicator proteins were screened out,including fragile X mental retardation syndrome-related protein 2,inositol-1-monophosphatase,Rho GDP-dissociation inhibitor 1,ankyrin-1,and methyltetrahydrofolate synthase domain-contai
16、ning protein.This study provides a basis for revealing the quality change mechanism,the freshness evaluation,and the preservation process improvement of L.crocea during the storage period with seawater slurry ice.Key words slurry ice;Larimichthys crocea;tandem mass tag;differential protein;freshness
17、 indicator protein大黄鱼(Larimichthys crocea)属石首科黄鱼属,富含蛋白质、矿质营养元素和脂肪酸等营养物质,其产量近年来稳居海水养殖鱼前列1-2。由于内源性酶和微生物的作用,大黄鱼极易腐败变质,保鲜期较短3。目前市售大黄鱼多采用冰鲜或低温冻藏方式来延长保鲜期。冰鲜通常因采用粒径较大的冰颗粒或冰块,极易造成鱼体破坏,且存在保鲜温度过高、保鲜期过短的缺点。低温冻藏又会造成盐析效应、蛋白质冷冻变性及细胞结构遭冰晶破坏等情况,导致解冻后的大黄鱼品质急剧下降4-5。因此,消费者普遍偏好食用冰鲜大黄鱼。流化冰为直径小于1 mm的微小冰晶与载液组成的固液两相匀浆状混合物,
18、其载冷能力强、终温低且可控6-7;对水产品的机械损伤小;具有隔绝空气、抑制微生物繁殖及脂质氧化的作用8,能有效延长水产品货架期9。因此,流化冰是水产品加工保鲜中极具潜力的绿色新型冷媒。本课题组前期采用微粒冰与海水(质量比为7 3,温度为2.2)制备的海水流化冰体系进行大黄鱼保鲜研究,发现较普通碎冰方式可以将大黄鱼保鲜期延长710 d。目前主要采用感官评价和理化指标分析方法进行大黄鱼新鲜度检测,近年来也应用了近红外光谱等新型无损检测技术10-11。这些技术研究通常都是从水产品腐败的节点入手来表征大黄鱼等鱼类的新鲜程度,较少涉及贮藏期内鱼类蛋白质分子变化及保鲜机制等方面。为进一步探究鱼类新鲜度变化
19、的机制,基于质谱和蛋白质组学的新鲜度研究技术逐渐得到发展。有研究采用蛋白质组学基于高通量质谱分析对生物体内的肽段/蛋白质组成进行鉴定,并结合生物信息学手段与特定的数据库进行比对,以期研究机体内蛋白质水平上发生的变化12-13。近年来,已有不少学者利用蛋白质组学研究大口黑鲈14、中华管鞭虾15、三文鱼16和金枪鱼17等水产品在贮藏期内的新鲜度及品质变化规律。串联质567第 49 卷浙 江 大 学 学 报(农业与生命科学版)谱标签(tandem mass tag,TMT)技术利用特异性化学标记实现对不同样本中的蛋白质同时进行定性和定量分析,具有高通量、高准确性和高分辨率等优点,在蛋白质组学研究中得
20、到广泛应用18。目前大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的蛋白质变化机制尚未见报道,本研究通过基于TMT的蛋白质组学分析技术筛选出大黄鱼在海水流化冰不同贮藏时间下的差异表达蛋白,通过基因本体(gene ontology,GO)分析、京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析、直系同源簇/真核生物直系同源簇(clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups,COG/KOG)功能分析以及差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标间的相关性分析,预测在
21、海水流化冰贮藏期内大黄鱼的新鲜度指示蛋白,旨在揭示大黄鱼的品质变化机制,为评价大黄鱼新鲜度提供新方法,同时为大黄鱼保鲜工艺改进提供新思路。1 材料与方法1.1 试验材料试验所用鲜活大黄鱼(体长3540 cm、体质量600700 g)于2021年9月在浙江省舟山市半岛水产养殖有限公司的养殖网箱内现场捕获,在充氧洁净海水的条件下快速运输至实验室。采用洁净冰水浸泡并处死鱼体,滤干表面水分后开展后续保鲜贮藏实验。1.2 主要设备与试剂SF03流态冰机(广州科勒尔制冷设备有限公司);Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪(high-performance liquid chromat
22、ograph,HPLC)(美国Agilent公司);EASY-nLC 1200 液相色谱系统、Q Exactive Plus 质谱仪、Multiskan FC 酶标仪(美国 Thermo Fisher Scientific公司);164-5050电泳仪(美国Bio-Rad 公司);TMT10plexTM标记试剂盒、甲酸(美国Thermo Fisher Scientific 公司);碘乙酰胺(iodo-acetamide,IAA)、尿酸(uric acid,UA)缓冲液、C18 EmporeTM固相萃取圆盘、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、三氟乙酸(trifluor
23、oacetic acid,TFA)、四乙基溴化铵(tetraethyl ammonium bromide,TEAB)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、氨水、碳酸氢铵(NH4HCO3)、甲酸铵(HCOONH4)(美国 Sigma 公司);C18固相萃取柱(美国Waters公司);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司);蛋白裂解缓冲液(
24、上海信裕生物科技有限公司);SDS、三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethyl aminomethane,Tris)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)生工生物工程(上海)股份有限公司;超微量Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)测试盒(南京建成生物工程研究所)。1.3 方法1.3.1 保鲜贮藏采用盐度为30的洁净海水制备海水流化冰体系,含微粒冰70%,冰粒粒径为0.30.6 mm,温度为2.2。将新鲜大黄鱼置于装有海水流化冰的泡沫箱内,使流化冰完全浸没鱼体,加盖密封后置于4 冷库贮藏,持续23 d,每天及时补充流化冰以保持体系中的含冰量。1.3.
25、2 样品前处理分别在试验开始后的第 0(新鲜)天、第 7 天、第23天取样,用于新鲜度指标测定和蛋白质组学分析,每个样品均设置3组平行试验。取大黄鱼背部肌肉组织样品,经搅碎混匀后装入聚乙烯密封袋,于18 条件下保存,用于新鲜度指标分析。另外取0.2 g大黄鱼背部肌肉组织样品,置于2 mL冻存管中,迅速放入液氮速冻3 h,随后转移至65 条件下保存,用于蛋白质组学分析。1.3.3 新鲜度指标测定pH值参照朱海滨等19的方法进行测定,总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)含量参照 食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定(GB 5009.2282
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