基于传统煎药工艺的生香附、醋香附和四制香附定性定量方法研究.pdf

（）基金项目 吉林省中药饮片炮制规范项目（项目编号：；项目名称：四制香附）作者简介 崔业波，男，副主任药师，研究方向：药物分析。：通讯作者 王丹，女，主任药师，研究方向：药物分析。：基于传统煎药工艺的生香附、醋香附和四制香附定性定量方法研究崔业波，马晓静，王丹，马（四平市食品药品检验所，吉林 四平 ）摘要 目的：基于传统煎药工艺，建立生香附、醋香附和四制香附的定性定量分析方法。方法：依据传统煎药工艺，制备生香附、醋香附和四制香附挥发油和水煎液。采用薄层色谱（）法，以香附烯酮和 香附酮为对照，对上述三者的挥发油定性鉴别；以香附对照药材为对照，对上述三者水煎液定性鉴别。采用高效液相色谱法，建立生香附、醋香附及四制香附中香附烯酮和 香附酮含量测定方法。结果：在 色谱图中，斑点清晰、分离度好。建立的含量分析法，香附烯酮、香附酮分别在 ，的范围内与峰面积呈良好的线性关系（），平均回收率依次为 （）和 （）。同一批香附中香附烯酮和 香附酮含量呈现生香附 醋香附 四制香附的规律。结论：本方法为生香附、醋香附和四制香附质量控制提供了参考。关键词 香附；醋香附；四制香附 中图分类号 文献标志码 文章编号 （），（，）：，：，（），（）：，（）（），：，；年第 卷第 期（总第 期）香附为莎草科植物莎草（）的干燥根茎，在 名医别录 中列为中品，具疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的功效，用于肝郁气滞、胸肋胀痛、疝气疼痛、乳房胀痛、脾胃气滞、脘腹痞闷、胀满疼痛、月经不调、经闭痛经。香附主产于陕西、甘肃、山东、江苏等省份，在中药组方和临床中使用历史悠久 ，。现代对其研究报道多集中于化学成分研究、药效学研究、炮制规范研究等方面 ；其炮制品较多，除 中国药典 收载的醋香附外，还有各具地方特色的炮制品，如酒炙香附、十制香附、酒醋炙香附和四制香附等 。其中四制方法各地存在较大差异，如“建昌帮”；甚至不同中成药中的制法也存在差异，如调胃消滞丸和抱龙丸。含挥发油类中药（如香附、荆芥穗等）在现代的制药工艺中，多采用挥发油提取设备提取挥发油备用，将水煎药渣与其他药味共煎，制备清膏，加入适当辅料，制颗粒，然后将提取挥发油回喷至颗粒中制成相应的剂型；该工艺广泛应用于诸多中成药中，如气滞胃痛颗粒、乳宁颗粒等。香附的炮制方法众多，在很多中成药中，香附的质控指标多以 香附酮为目标，或未建立相应的质控方法。本研究依据现代的应用技术，建立生香附、醋香附和四制香附的定性定量分析方法，为三者的质量控制及含香附类的中成药的探索性研究提供参考。材料 仪器 高效液相色谱仪（自 动 进 样 器 、检测器 、泵 ）（美国 公司），型电子天平（北京赛多利斯公司），超纯水系统（德国默克公司），半自动点样仪（瑞士卡玛公司）。试药香附烯酮对照品（批号：）来自上海诗丹德标准技术服务有限公司；香附酮对照品（批号：）来自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，公司）；水为超纯水。黄酒、食盐、米醋、生姜均本地 市 场 采 购。硅 胶 薄层层析板（青岛海洋化工有限公司）、高效硅胶 薄 层 层 析 板（烟 台 德 信 生 物 科 技 有 限公司）。三批香附粒来源分别为吉林省白山本苜药业有限公司（批号：）、河北一达药业有限公司（批号：）和吉林省北药药材加工有限公司（批号：）。所用样品经过四平市食品药品检验所马晓静副主任药师鉴定为莎草科植物莎草 的干燥根茎，经炮制加工而得香附粒。方法与结果 样品制备醋香附：分别取上述香附粒 ，加入 米醋拌匀，闷透，置 型炒药机内，炒干，筛去碎屑，即得。四制香附：分别取上述香附粒 ，加入 黄酒、米醋、生姜（取汁），食盐（倍量水溶解），闷透，置 型炒药机内，文火炒干，筛去碎屑，即得。分别取上述三批生香附粒、醋香附和四制香附粉末（过三号筛），约 ，精密称定，置圆底烧瓶中，加入 水，摇匀混合后，连接挥发油测定管，在挥发油测定管中加入 乙酸乙酯，再连接冷凝管，冷凝水温度约。加热至沸腾，再保持 。然后放冷至室温，分取乙酸乙酯层置 量瓶中，并用甲醇多次冲洗挥发油测定管，合并于量瓶中，作为供试品（），备用。同法制备空白。烧瓶中水煎液离心（转速为 ），分取 溶液，置分液漏斗中，加入 水饱和正丁醇，振摇提取，分别取正丁醇层和水层，置水浴上蒸干，依次作为供试品（）和（）。挥发油成分的鉴别取“”项下供试品（）作为供试品溶液。取香附烯酮和 香附酮对照品，分别精密称取 和 ，分别置 和 量瓶中，再分别精密量取 和 ，置 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按照 中国药典 年版四部通则 “薄层色谱法”进行试验，吸取上述两种溶液各 ，分别点于同一硅胶 薄层层析板上，以甲苯 乙酸乙酯（）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（）下检视。分别取香附粒、醋香附和四制香附，照上述方法试验，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同深蓝色斑点。见图 。正丁醇层成分的鉴别取“”项下供试品（），加 甲醇溶解，作为供试品溶液；另取香附对照药材 ，同法处理，得香附对照药材溶液。按照 中国药典 （）年版四部通则 “薄层色谱法”进行试验，吸取上述两种溶液各 ，条状点样，带宽 ，分别点于同一高效硅胶 薄层板上，以甲苯 丙酮 甲酸（）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（）下检视。注：空白；：三批香附粒；和 ：对照品（自上而下为 香附酮和香附烯酮）；：三批醋香附；：三批四制香附图 挥发油成分 图分别取香附粒、醋香附和四制香附，照上述方法试验，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图 。注：和 ：香附对照药材；：三批香附粒；：三批醋香附；：三批四制香附图 水煎液正丁醇层 图 水层成分的鉴别取“”项下供试品（），加 水溶解，作为供试品溶液；另取香附对照药材 ，同法处理，得香附对照药材溶液。按照 中国药典 年版四部通则 “薄层色谱法”进行试验，吸取上述两种溶液各 ，条状点样，带宽 ，分别点于同一高效硅胶 薄层板上，以正丁醇 甲醇 三氯甲烷 冰醋酸水（）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，置紫外光灯（）下检视。分别取香附粒、醋香附和四制香附，照上述方法试验，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图 。注：和 ：香附对照药材；：三批香附粒；：三批醋香附；：三批四制香附图 水煎液水层 图 含量测定 色谱条件色谱柱：（，）；以 甲 醇 水（）为 流 动 相，流 速 为 ，检测波长为 ，进样量为 ，理论板数以 香附酮色谱峰计不小于 。溶液的制备取“”项下供试品溶液和对照品溶液即可。专属性考察取上述混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，精密量取 ，注入液相色谱仪中，按照“”项下色谱条件分析，结果表明同法制备的空白溶液对含量分析无干扰。见图 。线性关系考察取“”项下对照品溶液，分别精密量取 、，注入液相色谱仪中，按照“”项下色谱条件进行分析，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以对照品质量数为横坐标进行线性回归，香附烯酮和 香附酮的线性回归方程依次为 （）和 （），表 明 香 附 烯 酮 和 香 附 酮 分 别 在 ，的范围内与峰面积呈良好线性关系。精密度试验取“”项下对照品溶液，精密量取 ，连续进样 次，按照“”项下的色谱条件测定，结果香附烯酮和 香附酮峰面积 分别为 和 ，表明仪器精密度良好。年第 卷第 期（总第 期）102030405060020406080 1.700 2.274 3.400102030405060020406080 27.711 46.380102030405060020406080 27.679 36.579 46.346 52.322102030405060020406080100120140 27.676 33.423 36.565 43.177 46.343 52.337t(min)t(min)t(min)t(min)t(min)102030405060A(mAU)A(mAU)A(mAU)A(mAU)A(mAU)020406080 27.660 36.572 46.332ABCDE12122112注：空白；：对照品；：香附粒；：醋香附；：四制香附；峰 ：香附烯酮；峰 ：香附酮图 专属性 图 稳定性试验取同一批香附粒（批号：），照“”项下制备供试品（）作为供试品溶液，分别在 、进样，测定对照品峰面积，香附烯酮和 香附酮峰面积 分别为 和 ，表明供试品溶液在 内稳定性良好。重复性试验取同一批香附粒（批号：）按照“”项下平行制备 份供试品（），作为供试品溶液，照“”项下色谱条件测定，结果香附烯酮和 香附酮含量 分别为 和 。加样回收率试验取同一批香附粒（批号：）约 ，精密称定，共 份。取香附烯酮（）和 香附酮（）对照品，分别置 和 量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀释至刻度。按照 加入上 （）述对照品溶液 和 后，按照“”项下制备供试品（）作为供试品溶液，按照“”项下条件测定香附烯酮和 香附酮含量并计算加样回收率，结果见表 。香附烯酮和 香附酮的回收率分别为 ，；，表明方法的回收率良好。表 加样回收率实验结果名称称样量（）样品中含量（）测定量（）加入量（）回收率（）平均回收率（）（）香附烯酮 香附酮 样品测定取上述香附粒和炮制后的醋香附和四制香附，依次照“”项下制备供试品（）作为供试品溶液，照“”项下色谱条件分析，计算样品中香附烯酮和 香附酮含量（按干燥品计）。结果见表 。表 含量测定结果批号香附粒（）醋香附（）四制香附（）香附烯酮 香附酮香附烯酮 香附酮香附烯酮 香附酮 讨论 薄层色谱鉴别挥发油薄层色谱鉴别，中国药典 一部“香附”项的薄层色谱鉴别方法中，展开剂采用二氯甲烷 乙酸乙酯 冰醋酸，其中的冰醋酸极性较大，导致香附烯酮斑点呈圆锥状。本研究建立的方法，改变了提取方式，并将展开剂改为甲苯 乙酸乙酯，改善了香附烯酮薄层色谱斑点的形状。该方法通过水煎煮提取，大大提高了方法的专属性。笔者将该方法应用到含有醋香附的成药中，如：柴胡疏肝丸和紫蔻丸，依然能有效地对成药中醋香附进行定性分析，阴性无干扰，可为此类成药中所含香附及其炮制品的定性分析提供参考。正丁醇层成分的鉴别，本研究是首次对该成分的鉴别报道。前期研究将提取液适量置滤纸上，热风吹干，置 紫外灯下，呈亮蓝色荧光，表明其成分存在分子内共轭结构。正丁醇层提取物呈盐酸 镁粉和 反应，表明提取物主要为黄酮类成分 。故检视方法优选 紫外灯检视。展开剂的选择，分别比较甲苯 丙酮 甲酸、三氯甲烷 乙酸乙酯 甲醇 水和二氯甲烷 甲酸乙酯 冰醋酸的展开剂，结果表明甲苯 丙酮 甲酸系统作为展开剂时，获得的斑点个数及清晰度最好。通过与普通薄层板相比较，高效硅胶 薄层板能获得明显好于普通薄层板的薄层色谱图。该方法为生香附及其炮制品的鉴别方法研究提供了参考。水层成分的鉴别，本研究是首次对生香附及其炮制品的水溶性成分鉴别报道。展开剂的选择依据笔者之前的中药多糖类成分薄层色谱研究工作获得。年第 卷第 期（总第 期）将适量提取液置滤纸上，吹干，在 紫外灯下呈亮黄绿色荧光斑点，并呈盐酸 镁粉反应，可见其分子存在黄酮类共轭结构 ，。由于水液较为粘稠，笔者将点样方式改为条状点样。点样量的考察，当点样量为 时，色谱中荧光斑条不尽理想，有较大面积暗斑条，考虑可能是样品超载所致，故将点样量降低，点样量改为 ，条带宽 时，荧光条斑清晰，但其数量明显减少；当喷以 硫酸乙醇后，加热处理，原来呈暗斑的成分在硫酸的作用下，呈明显的黄褐色荧光条斑。该方法的建立，为生香附及其炮制品的质量标准完善及评价提供支撑。样品的含量测定生香附粒分别经过醋炙和四制后，按照传统煎药工艺提取获得的挥发油中，香附烯酮和 香附酮含量的规律为生香附粒 醋炙香附 四制香附，且香附烯酮含量高于 香附酮，可见炮制方法对香附中挥发油含量影响较大。通过薄层色谱分析和 检测器全波长三维扫描，结果表明其挥发油主要成分为香附烯酮和 香附酮。本研究通过水煎煮，提高了方法的专属性。笔者并将该方法应用到含有醋香附的柴胡舒肝丸、紫蔻丸等成药中，结果呈现良好的专属性。本研究以应用为导向，以传统煎药工艺提取物为基础，建立生香附粒、醋香附和四制香附的定性定量分析方法。通过图 和图 可知：不同来源的生香附粒实验结果略有差异；生香附与炮制品也存在一定差异；醋香附的荧光条斑数与生香附粒和四制香附相比有一定的差异。本研究为现代香附及其炮制品的挥发油回喷技术及水煎液备用工艺提供质控参考；并对含有香附及其炮制品的中成药的全方位检验提供质控支持。参考文献 夏玲，严辉，郭盛，等 经典名方中香附的本草考证 中国实验方剂学杂志，（）：季宁平，卢君蓉，王世宇，等 香附的本草考证 中药与临床，（）：纪亮，雷敬卫，张维方，等 基于 技术研究不同产地加工方法对香附挥发性成分的影响 中国药学杂志，（）：纪亮，雷敬卫，张维方，等 不同产地加工方法对香附质量的影响 中国药房，（）：乔璐，张园园，王若晨，等 不同炮制方法对香附中香附烯酮和 香附酮的影响 中华中医药学刊，（）：卢君蓉，许娜，牟玉侦，等 基于 指纹图谱结合化学计量学的不同产地香附挥发油化学成分比较研究 中华中医药学刊，（）：，蒋莉娟，皮胜玲，方铁铮，等 香附药材 指纹图谱研究 中国当代医药，（）：王世宇，李文兵，卢君蓉，等 法同时测定不同产地香附药材中香附烯酮、圆柚酮和 香附酮 中成药，（）：胡律江，郭慧玲，赵晓娟，等 中药香附炮制前后的 分析 现代中药研究与实践，（）：刘聪，王丽霞，杨晓芸，等 四制香附炮制前后 指纹图谱比较及指标成分含量测定 中国实验方剂学杂志，（）：胡律江，赵晓娟，郭慧玲，等 基于目标成分“敲入”的四制香附质量控制研究 中华中医药杂志，（）：梁国嫔，蔡萍，黄莉 “建昌帮”四制香附与生品香附挥发油成分的差异分析 世界最新医学信息文摘，（）：刘献洋，朱昊，钱程 四制香附丸机械制丸工艺研究及工艺验证 现代中药研究与实践，（）：，胡律江，胡志方，郭慧玲，等 四制香附与生品香附挥发油成分的比较 中国实验方剂学杂志，（）：胡志方，胡律江，郭慧玲，等 基于均匀设计法的建昌帮四制香附炮制工艺评价 中国实验方剂学杂志，（）：田佳泽，江悦艇，陈奕霖，等 油莎豆豆粕中黄酮类物质的提取及工艺优化 农产品加工，（）：于明星，楚建芝，崔琪，等 姬松茸总黄酮提取条件的优化 食品安全导刊，（）：，陈燕媚，黄锁义 黄皮叶总黄酮的提取及鉴别 中国野生植物资源，（）：孙莲，李玲，阿布都许库尔吐尔逊，等 药桑叶中黄酮类物质的薄层色谱鉴别和活性筛选及含量测定的研究 化学研究与应用，（）：韦耀东，孙婷婷，刘海花，等 超声波提取桑葚总黄酮及鉴别 时珍国医国药，（）：（收稿日期：）