氮、磷对小球藻生长的影响--大学毕业设计论文.doc
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1、宁夏大学本科生毕业论文 第一章 文献综述( 2012 届)毕 业 论 文题 目 氮、磷对小球藻生长 的影响 学 院 化学化工学院 专 业 化学工程与工艺 年 级 2008 级 学生学号 学生姓名 指导教师 2012年5月7日III氮、磷对小球藻生长的影响 摘要:本文研究了氮、磷源对小球藻生长的影响。实验结果表明,当环境温度为25左右,pH在7.09.0之间时;小球藻最适氮源为硝态氮,且能够利用硝态氮、亚硝态氮、铵态氮和尿素进行生长,生长速度快慢为硝态氮亚硝态氮尿素铵态氮。以硝态氮为氮源时,小球藻在氮的浓度为0.16mgL-1左右,小球藻可以快速、大量的生长。以KH2PO43H2O为磷源时,磷的
2、浓度控制在0.36mgL-1左右时,明显促进小球藻生长。当N/P在3.2时,小球藻的生物量达到最大,并且小球藻对氮和磷的去除率都分别达到33%和89%。 关键词:小球藻;氮;磷;生长;The Influence of Nitrogen and Phosphorus to the Growth of Chlorella sp.Abstract:The effects of nitrogen and phosphorus on the growth of Chlorella sp. were reported in this paperChlorella sp. had grown at the
3、temperature of 25,the pH between 7.0 to 9.0The results showed that the growth of Chlorella sp. was affected by nitrogen with different morphologies,ordered as nitrate nitrogennitrite nitrogenurea nitrogenammonium nitrogenObviously,nitrate was the optimal nitrogen source for the growth of Chlorella s
4、p.The rate of growth was the highest at the nitrate nitrogen concentration of 0.16mgL-1When the content of nitrate was 0.36mgL-1,the growth of Chlorella sp. increased significantly with KH2PO4 as phosphorus sourceWhen the N/P ratio was 3.2:1,the biomass of Chlorella sp. reached the highest valueAnd
5、the removal rate of nitrogen and phosphorus could achieve 33% and 89%Key words:Chlorella sp.;nitrogen;phosphorus;growth目 录第一章 文献综述11.1 微藻的概述11.2 小球藻的应用21.2.1 食品、饲料和饵料上的应用21.2.2 医学上的应用21.2.3 污水处理上的应用31.2.4 作为生物质能源的应用31.3 影响小球藻生长的因素31.3.1 温度31.3.2 光照31.3.3 培养基pH41.3.4 培养基营养成分41.4 本课题的研究意义5第二章 实验材料与研究方
6、法72.1实验材料与仪器72.1.1 藻种的来源72.1.2 小球藻培养基配置材料72.1.3 主要仪器与试剂82.2 实验方法92.2.1 藻种的活化92.2.2 分光光度法测定藻细胞密度92.2.3 生物量的测定102.2.4 培养基中氮元素含量的测定102.2.5 培养基中磷元素含量的测定112.3 实验设计122.3.1 不同浓度梯度及不同形态N源的培养基配置122.3.2 不同P浓度梯度的培养基配置122.3.3 日常观察记录122.3.4 数据处理13第三章 实验结果与分析143.1不同氮源及含量对小球藻生长的影响143.2 不同浓度的磷源对小球藻生长的影响153.3 不同的氮磷比
7、对小球藻的生长及去除氮磷效率的影响153.4 结论16参考文献18致谢21宁夏大学本科生毕业论文 第一章 文献综述第一章 文献综述随着全球对能源的需求日益增长,世界各国对原油的争夺也日趋激烈。在战略上,能够拥有更多能源的国家,必将决定着其在未来发展中的国际地位。因此,越来越多的国家认识到可再生性能源的重要性。地球植物每年通过光合作用固定800亿吨碳,储存150亿吨标准煤的生物质能,其中40%来源于藻类的光合作用1。与大型藻类不同,微藻在光合作用时,能积累大量的油脂和淀粉。由于高效的光合作用能力和油脂积累能力,微藻单位占地面积产油量远高于现有大田作物。微藻是最有希望完全替代化石燃油的油料植物。其
8、中,小球藻作为常见藻种具有环境适应能力强、生长周期短、生长快、油脂含量高、养殖过程可以实现规模化培养等特点2,被广泛用于生产微藻生物柴油。因此,藻类生物燃料很可能成为未来最重要、最高效的可再生能源之一。1.1 微藻的概述藻类,尤其是海洋单细胞藻类(微藻)是地球上最早的生物物种,它们中的某些物种己经在地球上生存了近35亿年之久,并且分布很广。藻类是能够进行放氧光合作用的自养无胚植物,按照细胞大小可分为两类:大藻(如海带、紫菜、裙带等)和微藻(如小球藻、紫球藻、螺旋藻、纤细角毛藻等)。微藻一般是指那些在显微镜下才能辨别形态的微小藻类,严格来说是指单细胞的真核藻类,但它的范围也扩大到包括具有中央体的
9、某些蓝藻类植物(例如螺旋藻等)3。迄今已知的藻类约有3万余种,其中微藻种类约占70%。微藻细胞微小、形态多样、适应性强、分布广泛。1890年,荷兰生物学家Beijerinck首先在琼脂平板上成功分离到一种叫做小球藻(Chlorella sp.)的纯培养物。另一科学家Otto Warburg于1919年将这一纯培养物在实验室里作为研究植物生理学的材料,研究发现,小球藻可以进行光合作用,从而为小球藻的自养培养研究拉开了序幕4。 小球藻是绿藻小球藻科中的一个重要属,属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲目(Chloroeoecales)、卵囊藻科(Oocystacea)、小球藻属(Chlore
10、lla sp.)5。小球藻在自然界分布极为广泛,在海洋、湖泊、潮湿土壤中都可生长繁殖,在淡水中生长居多。我国常见的种类有蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、椭圆小球藻(C.ellipsoidea)和普通小球藻(C.vulgaris)6。小球藻不仅能利用光能进行自养生长,还能利用一些有机碳源进行异养生长7。小球藻生态分布广,易于培养,生长速度快,是进行生物技术研究的很好材料8。图1-1 显微镜下的小球藻示意图1.2 小球藻的应用1.2.1 食品、饲料和饵料上的应用小球藻是一种高蛋白、高多糖、低脂肪、富含多种维生素及矿物质的单细胞藻类9,因而具有多种保健功能,可作为功能食品和营养强化剂应用
11、于食品工业。小球藻主要以藻粉和抽提物的形式在食品工业中应用10。目前,已经开发出了如小球藻食品、小球藻饮料、小球藻绿酒、小球藻化妆品等11。小球藻可用于动物饲料添加剂,一方面可以为动物提供多方面的营养物质,另一方面增强动物免疫性12,长期使用,可利于动物的生长发育。小球藻可作为水产品的天然饵料,资料显示小球藻作为轮虫的首选饵料,能够增加轮虫体内的EPA和DHA的含量,而两种物质对水产品如鱼、虾等的生长发育有重要的作用13-15。1.2.2 医学上的应用早在1962年,小球藻就被列入了中国药典。人们对小球藻的营养保健功能做了广泛的研究,发现小球藻具有抗癌、抗辐射、抗感染、抗氧化等生理活性与保健功
12、能16-20。小球藻生长因子(Chlorela Growth Factor,CGF)又称小球藻精21,可以提高机体的免疫力和抗感染能力,还能防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病。小球藻具有抑制脂肪吸收和刺激高脂食品排泄的作用,可用于防治包括高血脂症在内与脂肪过剩有关的各种疾病。小球藻中还含有未知的生理活性物质,具有活化皮肤细胞,加速新陈代谢,延缓细胞衰老的功效,是优良的化妆品原料22。前苏联、日本等国均有将小球藻水溶性提取物添加剂加到护肤品和口红等化妆品的专利。1.2.3 污水处理上的应用水体的富营养化是环境治理的一大难题,其根本原因是水体的氮、磷超标,由于大量氮、磷污染物排入水体造成缓流水体的富
13、营养化23。现代污水处理方法主要分为物理处理法、化学处理法、物化处理法和生物处理法24。物理化学法处理费用较高,且易产生二次污染,所以普遍认为生物法除氮、磷最为经济有效。在氧化塘中利用固定化小球藻技术25处理废水,不仅有效地去除了废水中氮、磷等营养物质,还能超负荷吸收重金属,利用无机盐,降解农药、烷烃、酚类等多种有机物晰26。将富含养分的无毒废水进行资源化处理,处理水可用于农田灌溉和工业化生产,这为废水的资源化处理提供了一条新的高效而经济的途径。 1.2.4 作为生物质能源的应用生物质能源作为一种新兴的清洁能源,是我国目前需要重点发展的非化石能源之一。发展生物质能源最重要的问题就是寻找可再生的
14、、便于采收利用的生物质。微藻(包括海藻)的单位面积油产量是油料作物的十几倍,且不与人类争粮、争地和争水,如果善加利用,极有可能在短时间内成为我国的重要能源物质。微藻是指一些微观的单细胞群体,它是低等植物中种类繁多、分布广泛的一个类群,目前在作为生物柴油原料方面引起广泛的重视27。缪晓玲等28将微藻通过醋交换反应制备了生物柴油。能源微藻中小球藻可以进行工业化生产,是理想的能源微藻资源,适合大规模养殖生产生物柴油的小球藻目前引起越来越多的重视。1.3 影响小球藻生长的因素关于培养条件对小球藻生长影响的研究已有较多报道。这些研究结果表明, 其生长状况受到多种条件的影响,如温度、光照、pH、培养基等。
15、1.3.1 温度温度对小球藻的生长速度有较重要的影响。微生物的生长和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的,温度是保证酶活性的重要条件,因此,在微生物发酵系统中必须保证稳定而适合的温度环境条件。杨桂娟等29采用梯度法研究温度对小球藻生长量和溶氧量的影响,结果表明小球藻对温度的适应范围较广,530期间小球藻均可正常生长,25为小球藻生长的最适温度。刘艳等30在研究小球藻的优化培养时,认为其最适的培养温度为15。1.3.2 光照光合作用是绿色植物最基本、最重要的生命活动过程。光照是影响小球藻生长繁殖的最重要生态因子之一。在一定温度、pH和营养条件下,光照的强弱决定着小球藻光合作用的速率。一般情况下,
16、在一定光照范围内藻的光合作用效率会随光照强度的增加而增加,但光照强度达到一定值时,光合作用效率几乎保持在一定水平不再增加,这种现象称为光饱和效应。如果光照强度超过光饱和点后,藻的光合效率将会下降,导致细胞生长缓慢甚至死亡,即光抑制限制。严美娇等31在研究光照对小球藻生长速率及叶绿素含量的影响时,发现光照强度为5000lux时,小球藻的生长速率和叶绿素含量最大。毛安君等32在研究光谱对小球藻生长的影响时,发现连续光谱能够获得较高的最大生长率,蓝光促进生长的效率较高,两者组合能够较好地兼顾效率和速率。1.3.3 培养基pH培养基中的pH值是影响藻类生长代谢等许多生理过程的一重要因子,pH对小球藻的
17、蛋白质和叶绿素合成方面有显著影响,此外,还影响光合作用中CO2的可用性33。pH值较低,碳源主要以CO2和H2CO3的形式存在,不利于小球藻的利用;pH值较高,小球藻细胞易老化,细胞繁殖受到强烈抑制而导致生长缓慢。韦金河等34在研究不同氮、碳源对蛋白核小球藻培养液pH值的影响时发现,培养液的PH值达到10.00时,小球藻能正常生长;当pH值超过10.00时,小球藻发生藻细胞下降现象,但未影响其生长。贺立静等35在研究硫和pH对蛋白核小球藻光照产氢的影响时观察到,小球藻在pH为6.07.0时生长最佳。1.3.4 培养基营养成分微藻生长所需要的营养元素有15-20种,包括C、N、P、Mg、Fe、M
18、n、Mo、Co和Zn等。一般情况下,天然水体或土壤里的大多数元素都能满足它们的需要,不会成为限制因子。碳、氮和磷是微藻生长最重要的3种营养元素。Redfield36研究了微藻培养中碳、氮和磷元素的比例关系,试验表明,当微藻细胞接近饱和营养生长时,碳、氮和磷的原子比约为106:16:1,这一比例关系被称为Redfield比。根据这种比例关系,氮磷比高于30时,藻细胞的生长可能被磷抑制,而低于5时,则可能被氮抑制。碳是生物生长的一样重要元素,其可以分为无机碳源和有机碳源。碳酸盐或二氧化碳都能进入细胞为小球藻所利用。二氧化碳是小球藻自养生长条件下的普通碳源37。对于微藻异养培养,有机碳源是其能源和碳
19、源的来源,是培养基中最重要的营养物质。葡萄糖、半乳糖、醋酸盐、乙醇、乙醛和丙酮酸可作为唯一碳源支持小球藻的生长;葡萄糖、半乳糖和醋酸盐,可在无光条件下支持小球藻的连续生长38。马华继等39在分别含有Bold自养培养基、含葡萄糖的Bold培养基和含有NaHCO3Bold培养基的3种碳源培养实验中,发现以含葡萄糖Bold培养基的异养培养实验效果最好。夏云峰40在选取葡萄糖C6H12O6、醋酸钠NaAc和乙二醇C2H6O2三种有机物作为碳源来考察不同碳源及其含量对小球藻生长情况的影响,发现小球藻对乙二醇C2H6O2这种醇类的利用效率较低,可能存在抑制作用。氮是生物重要的营养成分,能够合成藻体内蛋白质
20、、核酸和叶绿素,同时也是形成嘌呤、嘧啶、朴啉、氨基糖和胺化合物的基本要素,因此氮对于藻类的生长、发育、繁殖等生理活动有着重要的作用,一般可占藻干重的1-11%41。藻类可利用氮源分为两类:一是非氨基酸类的简单氮源,包括尿素、铵盐、硝酸盐等;二是氨基酸类的复合氮源,包括酵母提取物、蛋白胨、玉米浆等。异养培养微藻,复合氮源比简单氮源更为有效,因为复合氮源可同时提供氨基酸、维生素和生长因子。尽管如此,硝酸盐一直是培养小球藻的一种普通氮源,这主要是从培养综合得率和成本考虑,以及无菌处理的方便性。但是,不同的氮源和浓度对微藻的生理生化特性影响较大,如微藻的生长状况、胡萝卜素、胞外多糖、脂肪酸的含量,以及
21、酶活性等42。张青田等43比较了不同氮源对金藻生长的影响,发现铵氮的增殖效应好于NH2CONH2。吴长斌等44报道铵氮对雨生红球藻的增殖效应极显著高于NaNO3。磷是藻类生长所必须的另一种重要元素。在微藻培养中,磷用于能量传递和核酸合成细胞的过程,主要以无机离子H2PO4-、HPO42-的形式被吸收。磷的消耗依赖于培养基中的磷浓度,细胞内的磷浓度,pH值,Na+、K+、Mg2+等离子的浓度和温度。细胞内的磷被用作合成有机或无机化合物。藻类用第五水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化三种不同的过程将其转化成高能有机化合物。前两个过程,能量来自呼吸底物的氧化,或来自线粒体的电子转运系统。在第三个系统中
22、,光能被转化结合进ATP。通过ATP的能量传递和光合作用以及呼吸作用过程形成高能化合物,这和细胞能量传递、细胞膜形成等密切相关。金相灿等45报道K2HPO4比-甘油磷酸钠更能促进铜绿微囊藻的生长。李定坚等46的研究发现不同pH值时,无论悬浮态还是固定态,镉在大多pH下使小球藻的磷吸收速率下降20%30%,固定处理并没有减少镉的影响,同样在个别pH下镉促进了对磷的吸收。黄旭光47研究了大量营养盐磷添加对两种微藻东海原甲藻和中肋骨条藻吸附和吸收重金属镍的影响,发现磷浓度的添加促进了两种藻类对镍的吸附,但对藻类吸收镍的影响不大。1.4 本课题的研究意义为了要更好地利用小球藻,首先要获得大量的小球藻藻
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