毕业设计-甘蔗生理生化测定指标全文.doc

土壤含水量的测定1土壤速效氮、磷、钾的测定2一. 土壤速效N的测定（碱解扩散法）2二. 土壤速效P的测定4三. 土壤速效K的测定（NH4OAc浸提，火焰光度计测定法）5土壤有机质测定（稀释热法）6光合作用强度测定81.LI-6400测定系统测定植物光合82.TPS-1光合作用测定系统操作方法10叶绿素含量的测定11植物组织中自由水和束缚水含量、相对含水量的测定13植物根系活力的测定（TTC法）16植物伤流液中糖和氨基酸的鉴定18膜透性的测定20植物组织中丙二醛含量的测定20脯氨酸含量的测定22过氧化物酶活性的测定25过氧化氢酶活性的测定26硝酸还原酶的测定29酸性、中性转化酶30植物组织中可溶性蛋白质含量的测定33（考马斯亮蓝G250染色法）33植物组织中可溶性糖含量的测定（蒽酮比色法）34叶片全N、P、K的测定36一、样品的消化36二、叶片N、P、K的测定37叶片全N的测定37叶片全P的测定38叶片全K的测定39土壤含水量的测定一、基本原理：用取土钻从田间取来土样，在100105恒温条件下，烘烤到干燥状态，并用烘干前后的重量求出土样的含水量占烘烤土样多采用电热恒温干燥箱，它能控制适宜的烘烤温度，因此测定结果比较准确，使用较广，但缺点是测定时间长。有的使用红外干燥箱，虽然缩短了烘土时间，但因温度较高，容易影响测定精度。采用简易加热设备的，则因烘烤温度不易控制，精度较差。称重烘干法是人工取土，劳动强度较大，又不能定点观测土壤湿度的连续变化，往往某些有机质在此温度时能逐渐分解而失重或氧化而增重。因此，用此法只能测得近似的水分含量。由于该法的准确度和精密度通常已达到土壤分析的要求，故测定土壤水分仍以烘箱法为准。二、仪器设备铝盒，土钻，天平，坩埚钳，干燥器，电子天平，分析天平，电热式恒温箱。三、测定步骤：1.在野外土壤水分观测点用土钻取样装入铝盒，取湿土重量一般以30-50g为宜，太少容易产生太大误差。每个观测点应作三次重复。2.称铝盒重：取有编号的铝盒一个，洗净，放入恒温箱中，敞开盖子，在105-110烘干30分钟，用坩埚钳取出放在干燥器中盖好盖子，冷却到室温（大约20分钟），在分析天平上称重，然后再烘20分钟称重，直到恒重为止，此为铝盒重（W1）3. 取代表性样品约1520克装入铝盒，在室内将装有土样的铝盒称重，在电子天平上用一张小纸称风干土壤样品，并将土壤平铺上述已知重铝盒中，盖上盖子，在分析天平上称量出铝盒加湿土的质量（W2）。每个样品至少重复三次。4.揭开铝盒盖，放入烘箱中，在105下烘至恒重（6-8h），用坩埚钳从烘箱中取出铝盒，盖好盒盖后放入底部有CaCl2的干燥器中约30分钟，如无干燥器则可放入磁盘或木盘中待至不太烫手时称质量。然后，再将样品放入烘箱中烘烤23小时，马上在分析天平上称重称量，即铝盒加烘干土的重量（W3）。一直到前后两次称量相差不超过0.05克时为止。三、结果计算：以烘干土壤为基础水分的百分数以风干土壤为基础水分的百分数式中： W2湿土铝盒重g W3烘干士铝盒重gW1铝盒重g 土壤速效氮、磷、钾的测定一. 土壤速效N的测定（碱解扩散法）1、原理：用1.0N氢氧化钠水解土壤样品，使土壤潜在有效氮，转化为氨气状态，不断逸出，由硼酸吸收，用标准酸滴定，然后计算出水解性氮的含量。2、仪器及试剂配制主要仪器：扩散皿、半微量滴定管、恒温箱试剂配制：（1）1.0N氢氧化钠 称取化学纯氢氧化钠40克，用水解溶解后冷却定容1升。（2）硼酸指示剂液 称取硼酸（H3BO3）20克加水900毫升稍稍加热溶解，冷却，加混合指示剂（0.099克溴甲酚绿和0.066克甲基红溶于100毫升乙醇中）20毫升，然后以0.1N 氢氧化钠调节溶液至红紫色（PH约5.0）最后加入水稀疏至1000毫升，使溶液混合均匀，贮存于塑料瓶中。 （3）0.005mol/L（1/2H2SO4）标准溶液 量取H2SO4（化学纯）2.83mL，加蒸馏水稀释至5000mL，然后用标准碱或硼酸标定之，此为0.020mol/L（1/2H2SO4）标准溶液，再将此标准液准确地稀释4倍，即得0.005mol/L（1/2H2SO4）标准液。（4）碱性胶液 取阿拉伯胶40.0g和水50mL在烧杯中热温至7080。搅拌促溶，约1h后放冷。加入甘油20mL和饱和K2CO3水溶液20mL，搅拌、放冷。离心除去泡沫和不溶物，清液贮于具塞玻瓶中备用。3、操作步骤：取通过60号筛的风干样品2.00克于扩散皿外室，水平的轻轻旋转扩散皿，使样品铺平。在扩散皿内室加入2%硼酸指示剂液2毫升，然后在扩散皿外室边缘涂上碱性甘油，盖上毛玻璃，并旋转数次，以使毛玻璃与皿边完全粘住，再慢慢转开毛玻璃的一边，使扩散皿漏出一条缝，迅速加入1.0N氢氧化钠5毫升于扩散皿外室，立即用毛玻璃盖好。水平轻轻旋转扩散皿，使溶液与土壤充分混匀，用橡皮筋固定，随后小心的放入40度的恒温箱中24小时取出，以0.01N硫酸标准溶液滴定扩散皿内室硼酸溶液吸收的氨量，终点是由蓝绿色转变红紫色，记下所用的标准酸量（V）4、计算结果：式中；c0.005mol/L（1/2H2SO4）标准溶液的浓度； V样品滴定时用去0.005mol/L（1/2H2SO4）标准溶液体积（mL） ； V0空白试验滴定时用去标准液体积（mL） 14.0氮原子的摩尔质量（gmol-1） W样品质量（g）； 103换算系数二. 土壤速效P的测定 鲍士旦主编.土壤农化分析.第三版.北京：中国农业出版社,2000.12:74-83中性和石灰性土壤速效磷的测定（0.5M碳酸氢钠法）1、原理: 石灰性土壤由于大量游离碳酸钙存在,不能用酸溶液提取有效磷.一般用碳酸盐的碱溶液.由于碳酸根的同离子效应, 碳酸盐的碱溶液降低碳酸钙的溶解度，也就降低了溶液中钙的浓度就有利于磷酸钙盐的提取，同时碳酸盐的碱溶液，也降低了铝和铁的活性，有利于磷酸铝和磷酸铁的提取。2、仪器及试剂配制主要仪器：往复振荡机、分光光度计试剂配制：（1）0.5M碳酸氢钠浸提液 溶解42.0克碳酸氢钠于800毫升水中，以0.5N氢氧化钠调节浸提液pH至8.5。此溶液暴于空气可因失去CO2而使pH增高，可于液面加一层矿物油保存。贮存超过一个月，应检查pH是否改变。（2）无磷活性炭 活性炭常常含有磷，应做空白试验，检查有无磷存在。含磷较多，须用2N HCl浸泡过夜，用蒸馏水多次后，再用0.5M碳酸氢钠浸泡过夜，在平瓷漏斗上抽气过滤，每次用少量蒸馏水冲洗多次，并检查到无磷为止。含磷较少可直接用碳酸氢钠处理即可。（3）磷标准溶液 准确称取105烘干过48小时的分析纯KH2PO4 0.2197克于小烧杯中，以少量水溶解，将溶液全部洗入1000毫升的容量瓶中，然后加 H2SO4 5毫升，用水定容至刻度摇匀，此溶液为磷标准溶液(50g/mL P)，吸取50毫升此溶液稀释至500毫升，即溶液为磷标准溶液(5g/mL P)（4）7.5N硫酸钼锑贮存液 A. 5gL-1酒石酸氧锑钾溶液：取酒石酸氧锑钾0.5g，溶解于100mL水中。 B. 钼酸铵硫酸溶液：称取钼酸铵10g，溶解于450mL水中，缓慢地加入153mL浓H2SO4，边加边搅。再将上述A溶液加入到B溶液中，最后加水至1L。充分摇匀贮于棕色瓶中此为钼锑抗混合液。（5）钼锑抗混合显色剂 于100毫升钼锑贮存液中，加入1.5克左旋抗坏血酸，此试剂有效期24小时，宜用前配制。3、操作步骤：称取通过20目筛的风干样品5.00克于200毫升三角瓶中，加入0.5M碳酸氢钠溶液100毫升，再加一角勺无磷活性炭，塞紧瓶塞，在振荡机上振荡30分钟，立即用无磷滤纸过滤，滤液承接于100毫升三角瓶中，立即用无磷滤纸过滤，滤液承接于 100mL三角瓶中，吸取滤液10mL（含磷量高时吸取 2.55.0mL，同时应补加0.5M碳酸氢钠浸提液至10mL）于150mL三角瓶中，再用滴定管准确加入蒸馏水 35mL，然后移液管加入钼锑抗试5mL，摇匀，放置30min后，用880nm或700nm波长进行比色。以空白液的吸收值为0，读出待测液的吸收值（A）。磷标准曲线绘制： 分别取5 Pg/mL磷标准溶液0、1、2、3、4、5mL于150mL三角瓶中，再加入0.5M碳酸氢钠10mL，准确加水使各瓶的总体积达到45mL，摇匀；最后加入钼锑抗试剂5mL，混匀显色。同待测液一样进行比色，绘成标准曲线。最后溶液中磷的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/mL。4、计算结果：式中式中：p由标准曲线计算出P的质量浓度（g/mL） V显色时定容体积 ts为分取倍数（即浸提液总体积与显色对吸取浸提液体积之比）； m风干土质量（g） k将风干土换算成烘干土质量的系数； 103将g换算成mg；三. 土壤速效K的测定（NH4OAc浸提，火焰光度计测定法）1、原理：以NH4OAc作为浸提剂与土壤胶体阳离子起交换作用。NH4OAc浸提剂常用火焰光度计直接测出。为了抵消NH4OAc的干扰影响，标准钾溶液也需要用1N NH4OAc配制。2、仪器及试剂配制： 主要仪器：火焰光度计、往返式振荡机。试剂配制：（1）1N 中性醋酸铵溶液 称取化学纯醋酸铵77.09克加水稀释，定容至近1L，用HOAc或NaOH调至PH7.0，然后稀释至1升。（2）钾的标准溶液的配制及标准曲线的绘制 准确称取烘干（105 4-6小时）的分析纯KCl 0.1907克溶于水中，定溶至1升，即含K100g/mL。然后分别准确吸取此100g/mL K标准液 0、 2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、40.0mL放入100mL容量瓶中，用1N 中性醋酸铵溶液定容，即得 0、2.5、5、10、15、20、40g/mL K标准系列溶液。3、操作步骤：称取通过1毫米筛孔的风干土5.00克于100毫升三角瓶中，加入50毫升1N中性NH4OAc溶液，塞紧橡皮塞，振荡30min，用干的普通定性滤纸过滤。滤液盛于小三角瓶中，同钾标准系列溶液一起在火焰光度计上测定，记录其检流计上的读数，然后从标准曲线上求得其浓度。4、结果计算：式中：V加入浸提液毫升数 W样品烘干重（克）土壤有机质测定（稀释热法）一、原理稀释热法（水合热法）是利用浓硫酸和重铬酸钾迅速混和时所产生的热来氧化有机质，以代替外加热法中的油浴加热，操作更加方便。由于产生的热，温度较低，对有机质氧化程度较低，只有77%。二、仪器及试剂配制仪器：试剂：（1）1mol/L（1/6K2Cr2O7）溶液。准确称取K2Cr2O7（分析纯，105烘干）49.04g溶于水中，稀释至1L。 （2）0.4mol/L（1/6 K2Cr2O7）的基准溶液。准确称取K2Cr2O7（分析纯）（在130烘3h）19.613g于 250mL烧杯中，以少量水溶解，将全部洗入1000mL容量瓶中，加入浓H2SO4约70mL，冷却后用水定容至刻度，充分摇匀备用其中含硫酸浓度约为2.5mol/L（1/2 H2SO4）（3） 0.5mol/LFeSO4溶液。称取FeSO47H2O140溶于水中，加入浓H2SO415mL，冷却稀释至1L或称取 Fe（NH4）2（SO4）6H2O196.1g溶解于含有 200mL浓H2SO4的 800mL水中。稀释至1L。此溶液的准确浓度以0.4mol/L（1/6 K2Cr2O7）的基准溶液标定之。即准确分别吸取3份0.4mol/L（1/6 K2Cr2O7）基准溶液各25mL于150mL三角瓶中，加入邻啡罗琳指示剂23滴（或加2羧基代二苯胺 1215滴），然后用0.5mol/LFeSO4溶液滴定至终点，并计算出FeSO4的准确浓度。硫酸亚铁（FeSO4）溶液在空气中易被氧化需重新配制或以标准的K2Cr2O7溶液每天标定之。（4）邻啡罗琳指示剂：称取邻啡罗琳（GB129377，分析纯）1.485g与FeSO47H2O0.695g，溶于 100mL水中。（5）浓硫酸三、实验步骤 1.土样的测定准确称取0.5000g土壤样品于500mL的三角瓶中、然后准确加入1mol/L（1/6K2Cr2O7）溶液10mL干土壤样品中，转动瓶子使之混合均匀，然后加浓H2SO420mL，将三角瓶缓缓转动1min，促使混合以保证试剂与土壤充分作用，并在石棉板上放量约30min，加水稀释至250mL，加34滴邻啡罗琳指示剂，用0.5mol/LFeSO4标准溶液滴定至近终点时溶液颜色由绿变成暗绿色，逐滴加入FeSO4直至生成砖红色为上。用同样的方法做空白测定（不加土样）。2.结果计算：式中：1.33为氧化校正系数；c为0.5mol/LFeSO4标准溶液的浓度；V0空白滴定用体积（mL）；V样品滴定用去体积（mL）；10-3将mL换算为L；3.01/4碳原子的摩尔质量（g/mol）；1.724土壤有机碳换成土壤有机质的平均换算系数。光合作用强度测定1.LI-6400测定系统测定植物光合实验原理LI-6400是一种开放型光合作用测定系统，即从进气口进入仪器主机的气体经主机头部一分为二，25%进入参考气体红外分析仪；75%进入样品气体红外分析仪,然后气体各自排出仪器。在光合作用测定过程中,有两种光源可供选择：一是自然光，用透明叶室；二是自动光源(为红光)，此时将叶室的透明部分换成含产生光的部分(用自动光源时需事先设定程序)。用自动光源测定时可测定植物的最大光合作用(Amax,即达到光饱和点时的光合作用)以及光合作用光照强度曲线。测定时,仪器根据参考气体与叶室气体CO2浓度差、气体流速、叶面积等参数计算光合作用或呼吸作用速率；根据参考气体与叶室气体H2O浓度差、气体流速、叶面积等参数计算蒸腾速率；根据参考气体H2O与叶室H2O浓度与蒸腾速率计算叶面水分总导度；又据此以叶片两面的气孔密度比率计算水分气孔导度即气孔导度(其倒数即为气孔阻力)；根据气孔水分导度、叶片两面气孔密度比率、叶面边界层阻力计算气孔对CO2的导度；最后,据气孔CO2导度、蒸腾速率、参考气体CO2浓度、光合速率计算胞间CO2浓度(Ci)。LI-6400能够测定的植物光合与水分生理指标有:净光合(呼吸)速率、蒸腾速率、总气孔导度、气孔导度或气孔阻力、胞间CO2浓度等。性能指标LI-6400主要性能指标有：工作温度050，相对湿度1080%(92%时仪器拒绝工作或停机)；CO2红外分析仪测定范围03000molmol-1,分辨率 0.1molmol-1，在01500molmol-1之间误差为5molmol-1，15003000之间为10molmol-1；H2O红外分析仪测定范围为07kPa或露点温度( Dew point )40，分辨率 0.001kPa，误差0.006kPa；光感应器测定范围为03000molm-2S-1，分辨率1molm-2s-1，误差7%。基本操作要点一、对LI-6400测定系统调零1.开机预热20分钟。 2.进入Open(开机)状态,按f3键，进入Calibration(标定)状态。3.将CO2去除剂(碱石灰)和水分干燥剂(均在主机左侧)上方的开关彻底打开(逆时针方向)，这样气流经CO2去除剂和水分干燥剂后,变成无CO2和H2O的空气进入红外分析部位。4.选择FlowRateZero(流速调零)，调气体流速为0，以电信号1mVmin-1为准。用荧屏左右的上下红色箭头键调节(下同)。5.选择IRGAZero(红外气体分析仪调零).首先调CO2为零，再调H2O为零，用f1、f2、f3功能键调之。要求CO2达到0.1Lmolmol-1，H2O0.01mmolmol-1。6.完成上述步骤后，将CO2去除剂和H2O干燥剂开关彻底关闭（顺时针方向,说明书上未提及此步骤）。然后将探头上进入样品分析室的塑料管(带黑色环者)打开,并与标准CO2钢瓶塑料管连接。7.选择IRGASpan(红外气体分析仪调跨度),然后分别调CO2-A和CO2-B(参考气体和样品气体CO2红外分析仪,下同)，用上下箭头调节，直至与标准气体CO2浓度相差1Lmolmol-1以内。8.完成上述标定后，选择StoreFlowRate(流速调零存盘)和StoreZero&SpanInformation(红外分析仪调零、调跨度存盘)存储标定参数，这样仪器即可在标定的状态下工作。二、测定1.在Open状态下,按f4键,进入New Measurement(测定)状态，按数字2后用f4设定温度，与环境温度不要相差太大；用f5设置光强。2.打开叶室，夹住被测植物叶片,使叶在叶室内的方向与其着生方向一致(用自动光源时不必作此要求)。3.待荧屏上CO2-A、CO2-B、H2O-A、H2O-B、光合作用、蒸腾作用等显示的数据基本稳定后(约需3分钟)，记录数据。4.记录数据在新的测量模式下按（1，f1）打开一个文件。输入文件名、记录号，当进行下一片叶测定时，用remark功能键重新做记录。5.按数字1，观察仪器测定和存储数据的次数，待完成给定的次数后，按f3关闭文件，进行下次测定。6.当所有的植物都测完以后，把仪器带回实验室，LI-6400与PC微机兼容的软件，将其装入计算机后可通过电缆将数据转入计算机。2.TPS-1光合作用测定系统操作方法 1.连接叶室，气路R、A与主机上的接口（R、A）对应连接。 2.打开主机电源时显示的第一个菜单是主菜单：1 REC测定与记录 2 校正 3 数据输出4 清除内存 5 时钟校正 6 诊断按1选择叶室：1 标准叶室 2 通用型叶室按21REC 记录类型 A：用内部时钟设置时间进行自动记录；M：按Record键进行手动记录，按1键可以在A和M之间转换。2INT 每次记录的时间间隔。FLO 叶室气体的流量。 Y N1: LIGHT 设置SUN为自然光，LAMP为人工光源。2: LEAF AREA 输入夹入叶室内的实际叶面积,以cm2为单位 Y N1P 是小区号,用户输入，用于识别不同处理的测定记录。R 是记录号，如果改变小区号，记录号重新设置为01。FREE RECORDS nnn存储器能够存储测定结果的数量。 Y (进入测定菜单状态)C为参比CO2浓度；+/-nnn 为分析气与参比气CO2浓度差值；Q 为量子通量密度；H 为参比水蒸气压；+/-nn.n 为分析气与参比气水蒸气压之间的差值；T 为叶室温度。 X （X转换键）E 蒸腾速率(mmolm-2s-1)；G 气孔导度(mmolm-2s-1)；T 叶片温度；A 净光合速率(molm-2s-1)，正值为净光合速率，负值为呼吸速率大于光合速率。CI 细胞间隙CO2浓度。在测定状态下按1/2/3返回到设置菜单；1用于改变记录方式；2用于改变光源或叶面积；3用于改变小区号。修改完毕，返回测定状态，按“Y”键。(3).选择待测叶片夹入同化室，给以适当的光照，观察CO2值变化，待CO2值稳定后(40秒左右)按X（转换键）观察记录结果，或按0/R，存储测定结果。一个叶片的测定结束，进行另一叶片的测定。测定结束，按N键返回到主菜单，关机。叶绿素含量的测定张宪政主编，作物生理研究法，农业出版社，1992：145-150基本原理根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即ACL式中：比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。叶绿素a和叶绿素b的光谱吸收锋虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此又有重叠，这种情况下，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。OD1=82.04Ca+9.27Cb (1)OD2=16.75Ca +45.6Cb (2)式中，Ca为组分a(叶绿素a)的浓度；Cb为组分b(叶绿素b)的浓度；将表中数值代入上式（1）、（2），经整理，得到下式：Ca0.0127 OD10.00269 OD2Cb0.0229 OD20.00468 OD1如果把Ca 、Cb的单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：Ca12.7 OD12.69 OD2 (3)Cb22.9 OD24.68 OD1 (4)CtCa+Cb8.04 OD1+20.29 OD2 (5)式中，Ct为总叶绿素的浓度，单位是mg/L。利用式（3）（4）（5）可以计算叶绿素的量。一、材料、仪器设备及试剂（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子天平（感量0.01g）；3.棕色容量瓶；4. 定量滤纸；5. 吸水纸；6. 擦镜纸。（三）试剂：96乙醇；80丙酮；去离子水或蒸馏水二、实验步骤丙酮乙醇水混合液法（丙酮乙醇混合液法）1取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2称取剪碎的新鲜样品0.5g，共2份，放入25mL的容量瓶中，然后加入乙 醇 : 丙酮:水=4.5:4.5:1 的提取液到刻度，静置暗处提取12小时。（准确称取0.1左右，放入具塞得三角瓶或刻度试管中，加混合提取液10ml盖塞，在室温下（10-30度）暗处提取，直至材料变白（因材料不同需1-8h）。对于少量样品如需短时间内测定，则应将三角瓶或试管放在50-60度，的水浴中快速提取20min-1h即可变白）3.取上清液在663nm和645nm波长下测定光密度。三、计算方法及公式（V=9mL）叶绿素a含量=植物组织中自由水和束缚水含量、相对含水量的测定一、原理 自由水未被细胞原生质胶体颗粒吸附而可以自由移动、蒸发和结冰，也可以作为溶剂。束缚水则被细胞原生成胶体颗粒吸附而不易移动，因而不易被夺取也不能作为溶剂。基于上述特点以及水分依据水势差而移动的原理，将植物组织浸入高浓度（低水势）的糖溶液中一定时间后，自由水可全部扩散到糖液中组织中便留下束缚水。自由水扩散到糖液后（相当于增加了溶液中溶剂）便增加了溶液的重量同时降低了溶液的浓度、测定降低了的糖液的浓度。再根据原先已知的高浓度溶液的浓度及重量，可求出浓度降低了的糖液的重量。用浓度降低了的溶液的重量减去原来高浓度溶液的重量即为植物组织中的自由本的重量（即扩散到高浓度溶液中的水的重量）。最后，用同样的植物组织的总含水量减去此自由水的含量即是植物组织中束缚水的含量。二、仪器设备及试剂配制仪器设备： 阿贝折射仪，分析天平或电子顶载天平（感量0.1mg），烘箱，干燥器，称量瓶打孔器（面积0.5cm2左右），烧杯，瓷盘，托盘大平（感量0.1g），量筒。试剂： 重量百分浓度为6065的蔗糖溶液：用托盘天平称取蔗糖6065g，置烧杯中，加蒸馏水4035g，使溶液总重量为100g，溶解后备用。三、实验步骤 1-3 周祖贵，黎兆安主编.植物生理学实验指导（广西大学内部资料）2005：5-6 1、植物组织中总含水量的测定 （1）取称量瓶3只（三次重复，下同），依次编号并分别准确称重。 （2）在田间选取生长一致的待测的植物数株，各选部位、长势、叶龄一致的有代表性叶数片，用打孔器钻取小圆片50片（注意避开粗大的叶脉），立即装到上述称量瓶中（每瓶随机装入50片），盖紧瓶盖并精确称重。（3）将称量瓶连同小圆片置烘箱中105下烘15min以杀死植物组织细胞，再于8090下烘至恒重（称重时须置干燥器中，持冷却后称）。设称量瓶重量为W1，称量瓶与小圆片的重量为W2，称量瓶与烘干的小圆片的重量为W3（以上重量单位均为g，下同），则植物组织的总含水量（）可按下式计算：2、植物组织中自由水含量的测定（1）另取称量瓶3个，编号并分别准确称重。（2）用打孔器打取小叶圆片150片（植物材料的选取同上）立即随机装入三个称量瓶中（每瓶装50片），盖紧瓶盖并立即称重。（3）三个称量瓶中各加入6065的蔗糖溶液5mL左右，再分别准确称重。（4）各瓶于暗处置46h（经减压处理后，只需在暗处置lh），其间不时轻轻摇动。到预定的时间后充分摇动溶液。用WZS-1阿贝折射仪分别测定各瓶糖液浓度，同时测定原来的糖液浓度。设称量瓶重量为W1，称量瓶与小圆片的重量为W2，称量瓶与小圆片及糖液的重量为W3，糖液原来的浓度为C1，浸过植物组织后的糖液的浓度为C2。则植物组织中自由水的百分含量可由下式算出：3、植物组织中束缚水含量的计算植物组织中束缚水的含量=组织中总含水量组织中自由水含量（）4、植物相对含水量的测定方法张宪政主编，作物生理研究法，农业出版社，1992：119-120根据邹琦主编的植物生理学实验指导蔗叶取样，称鲜重（G1）；浸水5-6小时，取出擦干，称重。再浸水1小时，取出擦干，称重，直至样品饱和重量近似，得饱和鲜重（G2），然后烘干至恒重，称干重（G3）。按下式计算：自然饱和亏：自然饱和亏（%）=100相对含水量（%）植物根系活力的测定（TTC法）张宪政主编，作物生理研究法，农业出版社，1992：142-143一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准的氧化还原色素（氧化还原电位为-80mv），其氧化态无色并溶于水，还原态则是不溶于水的红色物质（TTCH），它在空气中不会自动氧化、相当稳定。所以可用TTC作为脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶）的氢受体。脱氢酶活性与根系活力成正相关，由红色生产物质的量（还原力）即可测定根系活力。二、仪器设备及试剂 仪器设备： 分光光度什，分析天平（感量0.1mg），电于顶载天平（感量0.1g），温箱，研钵，三角瓶，漏斗，量筒，吸量管，刻度试管，试管架，容量瓶 ，药勺，石英砂适量，烧杯。 试剂： （1）乙酸乙酯（分析纯） （2）次硫酸钠（Na2S2O4，分析纯）粉末。 （3）1TTC溶液。准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100mL。用时稀释至需要的浓度。（4）磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH 7）。（5）1mol/L硫酸。用量简取比重1.84的浓硫酸55 mL，边搅拌边加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至 1000 mL。（6）0.4mol/L琥珀酸。称取琥珀酸4.72g溶于水中，定容至100mL即成。三、实验步骤1、TTC标准曲线的制作。取0.4TTC溶液0.2mL放入 10 mL容量瓶，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的物质。再用乙酸乙酯定容至刻度，显匀。然后分别取此液0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL置 10mL容量瓶中用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含25g、50g、100g、150g 、200g的标准比色系列，以乙酸乙酯为空白，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。2、称取根尖样品0.5g放入10mL烧杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10mL，把根充分浸没在溶液内，在37下暗保温13 h，此后加入lmol/L硫酸2mL，以停止反应，并准确计时。（与此同时做一空白实验，先加入硫酸后加入根样品，37下暗保温，其溶液浓度、操作步骤同上）3、把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯34mL和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出红色物质、红色提取被移入试管，井用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二三次皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为 10 mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作对照测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。4、结果计算修改后计算公式：植物伤流液中糖和氨基酸的鉴定-王晶英，敖红等编.植物生理生化试验技术与原理，东北林业大学出版社，2003:99-101植物根系是植物吸收水分和矿质元素的重要器官，也是许多重要物质的合成和贮存器官。伤流液中含有糖、氨基酸、激素等许多物质，伤流量的多少受土壤水分、温度、通气状况等外都因素的影响，也与植株生长、根系发达程度及生命活动强弱等内部因素有关。因此伤流液的数量和成分可作为根系活力强弱的指标。一、原理用蒽酮试剂处理可以鉴定伤流液中糖的存在，并可测定其含量。氨基酸与茚三酮在水溶液中可发生显色反应，除脯氨酸与羟脯氨酸外，其他各种氨基酸显色的色调与深浅相差不大，因此利用此应应可测定植物体氨基酸的总量。二、仪器设备及试剂仪器设备：分光光度汁。水浴锅及加热设备，引流玻管，移液管，橡皮管管，刻度试管，刀片。试剂配制 （1）蒽酮试剂 10g蒽酮溶于1000mL稀硫酸（由 760mL比重为 1.84的硫酸用水稀释成1000mL）。 （2）95乙醇。 （3）3茚三酮乙醇溶液。（4）500mg/L的谷氨酸标准溶液。三、实验步骤1.伤流液的收集 选择生长健壮大小适合的植株，在离地面35cm处用刀片切去地上部分，在地面断茎上套上橡皮管，将已弯好的引流玻管较短一端套入橡皮管内较长的一端插入刻度试管中或三角瓶中，整个过程要防止伤流液漏出，并用塑料薄膜封住管口以免伤流被蒸发或外界污物进入。用时剪一小口将引流管插入、收集时间依具体情况而定，记录收集伤流液的时间和伤流液量，计算伤流量（mL/h）2.伤流液中可溶性糖的鉴定取伤流液1mL和1mL蒸馏水分别加入两支干净试管中，再分别加入蒽酮试剂5mL混匀，沸水浴中煮沸510min，绿颜色出现即表示有糖的存在其深浅与糖的含量成正比。 3.伤流液中氨基酸总量的测定（1）取6支试管按下表，加各种试剂，以制作标准曲线。试剂123456500mg/l谷氨酸/ml00.10.20.30.40.53%茚三酮乙醇溶液/ml0.50.50.50.50.50.5蒸馏水/ml1.51.41.31.21.11.0谷氨酸含量/g050100150200250（2）再取第七支试管加入伤流液0.5mL，加蒸馏水1mL，茚三酮乙醇溶液0.5mL，以测定伤流液中氦基酸含量。（3）将上述已加好各种试剂的 7只试管摇匀后，在沸水浴中准确加热10 min。溶液变为蓝色，表示有氨基酸存在，取出后立即加入 5mL95乙醇，摇匀，冷却后以乙醇作空白对照，于520nm波长下测定吸光度。 4.结果计算膜透性的测定周祖贵，黎兆安主编.植物生理学实验指导（广西大学内部资料），2005：119-120一、原理 植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破坏而使其透性增大，细胞内的各种水溶性物质包括电解质将有不同程度的外渗，将植物组织浸入无离子水中，水的电导将因电解质的外渗而加大，伤害愈重，外渗愈多。电导度的增加也愈大。故可用电导仪测定外液的电导度增加值而得知伤害程度。二、仪器N个三角瓶、蒸馏水、胶头滴管、电导计、量筒、抽气室、电子天平三、实验步骤 1.准确称取1.000g甘蔗叶片（约1cm2/片）于三角瓶， 加30ml水，称重（带瓶、叶、水），抽气20分，静置20分，摇匀，测定电导率值（常温下电导率值，记电导率单位），煮沸10分，冷却，加水至原总重W，摇匀，测电导率。2.结果计算：植物组织中丙二醛含量的测定周祖贵，黎兆安主编.植物生理学实验指导（广西大学内部教学材料），2005：114-115赵世杰.植物组织中丙二醛测定方法的改进，植物生理学通讯，1991.30（3）：207-210一、原理 植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155m mol/（Lcm），并且在 600nm波长处有最小光吸收。但是测定植物组织中的MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖。糖与TBA显色反应的最大吸收波长在450nm，在532nm处也有吸收。植物受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增大，因此测定植物组织中的MDA时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要排除。低浓度的铁离子能显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532nm、450nm处的吸光值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需要有一定的铁离子。在450nm、532nm、600nm波长处测定吸光值，即可计算丙二醛含量。二、仪器设备及试剂配制仪器设备： 研钵，试管可调加样器，恒温水浴锅，冷冻离心机，分光光度计。 试剂配制：（1）10三氯乙酸（TCA）：称取10.0g三氯乙酸，用蒸馏水定容至100mL。（2）0.6硫代巴比妥酸（TBA）：称取TBA0.6g，用5三氯乙酸定容至100mL。三、实验步骤1、取 1.0 g植物样品（叶、根），加 10 TCA 3mL和少量的石英砂，研磨，然后再加入10 TCA7mL冲洗研钵，所得匀浆在4000r/min下离心15min。2、取上清液3mL，加0.6TBA 3mL，混合后在100水浴上煮沸15min，冷却后再离心一次。3、分别测定上清液在 450nm、532nm和 600nm处的吸光度值。四、结果计算由蔗糖TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.410-3，MDA-TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别为7.410-3和15510-3。532nm非特异性吸光值可以在600nm波长处的吸光值为代表。按双组分光度法原理，建立方程组，借此方程组可以求出MDA及可溶性糖浓度。方