DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤.doc

一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA
核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是：
1、样品的物理性状
即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
2、支持物介质
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。
琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的DNA分子。
3、电场强度
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
4、缓冲液离子强度
核酸电泳常采用TAE、 TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。
缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。
使用溴化乙锭对DNA 样品进行染色，可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，但是如果要测定核酸分子大小时，不宜使用以上方法，而是应该在电泳结束后，把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10～30min进行染色。BE见光分解，应在避光条件下4℃保存。
三、材料、试剂及器具
1、材料
ΛDNA/HindⅢ Marker（分子量标准）；实验37的质粒提取物；实验39的酶切产物；实验40的连接产物。
2、试剂
加样缓冲液（6x）：0.25% 溴酚兰，40%蔗糖；琼脂糖；溴化乙锭（EB）；酶液（10mg/ml）。
3、器具
（1）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。
（2）紫外透射仪。
四、操作步骤
1、按所分离的DNA分子的大小范围，称取适量的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。稍摇匀，得胶液。冷却至60℃左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。
2、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。
3、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。
4、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
5、在槽内加入0.5×TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面
6、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。
1μl加样缓冲液（6×）+5μl待测DNA样品
〔+0.5μlEB 液（10mg/ml）（注：若胶内未加EB，可选用此法）。〕
7、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
8、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。
9、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约30min。
10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。
五、注意事项
1、电泳中使用的溴化乙锭（EB）为中度毒性、强致癌性物质，务必小心，勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作，戴一次性手套，并及时更换。
2、预先加入EB时可能使 DNA的泳动速度下降15%左右，而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB，染色步骤可省略；若凝胶放置一段时间后才观察，即使原来胶内或样品已加EB，也建议增加此步。
3、加样进胶时不要形成气泡，需在凝胶液未凝固之前及时清除，否则，需重新制胶。
4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时，溴酚兰在0.5%～1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度，而二甲苯青 FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。