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培养基模拟培养基模拟 灌装试验灌装试验无菌的概念无菌的概念什么是无菌什么是无菌?理论上：无菌没有任何活的微生物理论上：无菌没有任何活的微生物实际上：我们无法证明产品中没有活微实际上：我们无法证明产品中没有活微生物存在生物存在无菌的概念无菌的概念“无菌无菌”的实际定义的实际定义:经生长和繁殖证明无生物经生长和繁殖证明无生物 实际为概率上的无菌，普遍接受的标准是：实际为概率上的无菌，普遍接受的标准是：最终灭菌无菌制剂：微生物存活的概率达到最终灭菌无菌制剂：微生物存活的概率达到1010-6-6，即保证，即保证一百万个已灭菌物品或制剂中存活的微生物数低于一。一百万个已灭菌物品或制剂中存活的微生物数低于一。非最终灭菌无菌制剂：目标是零生长，但在污染率低于非最终灭菌无菌制剂：目标是零生长，但在污染率低于0.1%0.1%，可信度在，可信度在95%95%时是可以接受的。时是可以接受的。什么是污染率低于0.1%？计算公式：实际污染率=(95%置信限值)/(灌封容器数)100%培养基灌装试验的批量与判断合格的标准批量（瓶）3000475063007760允许污染的数量（瓶）0 1 2 3无菌检查的局限性试验目的：不合格的可能性试验目的：不合格的可能性(%)(%)试验批量：试验批量：60,00060,000支支试验方法：按无菌测试方法试验方法：按无菌测试方法真实的不合格率测试20支样品不合格的可能性测试40支样品不合格的可能性118.2%33.1%564.2%87.2%1596.1%99.8%风险：风险：结合了发生危害的可结合了发生危害的可能性和危害的严重性能性和危害的严重性严重性严重性可能性可能性高高中中低低探测能力探测能力评估风险的参数评估风险的参数风险评估风险评估可能性可探测性严重性风险最终灭菌的无菌制剂较小很差严重大非最终灭菌的无菌制剂较大很差严重很大非最终灭菌制剂的风险大不大？我们如何做到上述的无菌保障水平 无菌生产工艺什么是无菌生产工艺？什么是无菌生产工艺？无菌生产工艺产品、容器和密封件分别进行灭菌，然后进行灌封在极高洁净环境下进行灌装和密封产品在最终容器中不再做进一步的灭菌处理对各个组成部分的灭菌工艺需要进行严格验证和监控在灌封前和灌封过程中的操作会带来污染风险什么是无菌生产工艺？什么是无菌生产工艺？生产环境洁净区人员药液制备和过滤药液除菌过滤前的微生物负荷过滤器完整性测试和验证生产设备和内包装材料的准备和灭菌灌装过程转运冻干轧盖无菌工艺过程验证什么是无菌生产工艺？什么是无菌生产工艺？PersonnelEnvironment工艺验证人员原料环境无菌检验作业环节与风险作业环节与风险作业环节验证难易度人员依赖程度相关风险灭菌易低低房间设计N/AN/A中等环境监测中等可变高消毒难高高更衣难很高很高物品转移难高高无菌技术（灌封）难很高很高无菌装配难很高很高无菌操作最重要的部分无菌操作最重要的部分个人认为是 所有操作人员的无菌保障意识为什么需要进行培养基灌封试验？为什么需要进行培养基灌封试验？无菌生产工艺是制药领域中最难的工艺之一，确保产品无菌是该工艺最大的难点。减少无菌工艺药品污染风险的两项重要措施。.人员培训 .无菌工艺验证定义定义使用培养基模拟药品进行无菌灌封，对无菌工艺进行验证。又称为“工艺模拟试验”.目的证明生产线采用无菌工艺生产无菌产品的能力对人员进行资格确认符合GMP的要求试验前的准备工作试验前的准备工作设备确认通风系统（HVAC）、水系统的验证设备的清洗和消毒CIP,SIP灭菌工艺验证湿热、干热灭菌工艺除菌过滤的验证空气过滤器的完好性检测容器/胶塞密闭性测试人员培训洁净室环境达到设计要求培养基灌装的原则培养基灌装的原则通常情况下，应该包括产品实际操作过程中可能发生的“最差条件”必须考虑可能采取那些干预措施?最差条件 高于或低于正常范围的条件限度，与正常生产条件相比最有可能造成工艺或生产失败的条件。注意 如果某些做法会带来污染的风险，则不允许用培养基灌封的结果为它的不合理的进行辩护。培养基灌装方案培养基灌装方案需要考虑的关键因素:起始步骤起始步骤试验的次数和频率试验的次数和频率 培养基及培养条件培养基及培养条件 灌装数量灌装数量容器体积容器体积灌装体积灌装体积灌装速度灌装速度培养基灌装方案培养基灌装方案灌装过程的持续时间灌装过程的持续时间人员和工作班次人员和工作班次环境监测措施环境监测措施 干预措施干预措施 容器的检查容器的检查 培养方法培养方法可接受标准可接受标准 污染调查污染调查关键因素一:起始步骤 新版GMP第四十八条：。应尽可能模拟常规的无菌生产工艺，并包括所有对结果有影响的关键生产工序。1、从配制开始：冻干制剂从液体配料开始，需要更多量的培养基，考察的最全面。（如工艺要求配好的液体需要在配制罐中蒸汽灭菌的应从配制开始）2、从除菌过滤前开始：考察的内容包括除菌过滤系统，考察较全面，培养基不需要灭菌，需要考虑生物负荷。3、从除菌过滤后面开始：只考察灌封等操作过程，培养基需要事先灭菌。关键因素二:试验的次数和频率培养基模拟试验的初始验证，至少需要成功的连续进行 3 次独立的模拟试验（建议在不同的工作日进行试验）。首次验证后，培养基模拟试验通常每年进行2次，每次进行1批即可。当生产线发生变更，并且经过评估可能对无菌生产工艺有潜在危险时，应当进行额外的培养基灌装试验。关键因素三:培养基及培养条件(1/3)培养基必须适应广谱微生物的生长，包括需氧菌、酵母菌和霉菌（非选择性培养基）。较好的澄明度，较小的粘度，易于除菌过滤。推荐使用大豆消化酪素琼脂培养基(SCD)，以及大豆胰蛋白胨肉汤(TSB)。如果产品在缺氧条件、通常在氮气保护下灌装时，或在环境中分离出厌氧菌时，可能需要使用厌氧培养基:液体硫乙醇酸盐培养基(FTM)。关键因素三:培养基及培养条件(2/3)培养基必须做促生长试验，按药典方法（10版药典新规定）进行评价。有条件的推荐使用12种最常见的环境分离菌。促生长试验可以同步或14天培养后进行。用于促生长试验的培养基培养前需经过同样的工艺步骤（例如清洗、灭菌、充氮、灌装、冻干等）通常情况，在培养结束后，一些玻璃瓶（从生产开始、中间、结束时取样）进行微生物接种。关键因素三:培养基及培养条件(3/3)培养温度 全部样品应在20-35(2.5)下培养14天。通常在 20-25下 培养 7 天，然后在30-35下培养 7 天；或者在30-35培养 7 天后，再转移到 20-25培养 7 天。原则：选择的温度适宜那些从环境中分离的微生物或生物负荷中的微生物的培养。关于培养条件的选择，补充一个没有形成共识的建议，在培养过程的前半个周期，将所有产品进行倒置后培养；然后在剩余时间内，将产品恢复直立位置后进行培养。关键因素四:灌装数量灌装的数量应该能够真实的反应批量；但允许根据需要，采取最低灌装数量，前提是应足以反应操作员工疲劳时对产品质量潜在的影响，并且足以体现了尽可能发生的干预措施。一般生产量小于5000，培养基灌装数量应等同批量；生产量大于5000时，培养基最小灌装数量不少于5000。一些法规中建议应该根据批量确定灌装的数量。关键因素五:容器体积(1/2)应该考虑到灌装容器的极端尺寸。最大的容器（通常由于充填体积较大而导致最小的充填速度）通常开口较大，所以从环境中微生物侵入的潜在风险是最大的。最小的容器（通常由于充填体积较小而导致最大的充填速度）体现了最大的操作难度；小的容器更容易破碎，稳定性差，在设备中更容易破裂或堵塞。关键因素五:容器体积(2/2)在最初的验证中，可以二次选用最大的容器（配合一次最慢、一次最快的灌装速度），第三次选用最小的容器（配合最快的灌装速度）。在每年2次的再验证中，用其它规格尺寸的容器轮转试验。不能使用琥珀色的容器，而应该使用透明的容器，保证可以目视检测到微生物的生长。关键因素六:灌装体积培养基灌装体积不需要与现实中常规的灌装体积一致。（可能因为模拟装量调节过程，使有包含不一致的培养基装量）应确定足够的灌装体积，保证可以充分接触到容器和密封部位的表面(当它倒置和旋转时)，并且足以目视检测到微生物在培养后的生长情况。较小的容器不能灌装的太满，因为容器上部的空间中应保持足够的空气，以支持需氧微生物的生长（通常应该保留25%的空间）。关键因素七:灌装速度培养基灌装的速度，应符合实际生产的灌装速度范围。如果超过了限度，应该进行评估。每次模拟试验中确定的速度应该是符合要求的。较高的生产速度，可以适用于生产过程中经常受到干扰或手工操作较多的生产工艺。较低的生产速度，可以应用于在无菌区域中无菌部件长时间暴露的生产工艺。在灌装生产线的起始验证中，一次可以选用最低速度，另外二次可以选用最高速度。在生产线的每年2次的再验证中，模拟试验的速度应该进行变换。关键因素八:灌装的持续时间通常情况，培养基灌装的时间应该足够长，能够包括所有的必需的干扰、生产中断，包括正常的无菌操作如开始前的安装、重量或体积的调整、改变设备或手动维修等，还包括更衣、暂停、换班等，持续时间还应能反映出潜在的人员疲劳。对于非常大的批量或较长的生产过程，通常使用一些空白样品（空的或者灌水）以维持模拟试验的动态环境。这些技术可以应用于持续多个工作日的工艺验证，用于验证可以批准的最长的生产周期。关键因素九:人员和工作班次需要进行无菌工艺操作的每个操作员工包括设备工程师和环境取样人员应该每年参加不少于一次成功的模拟试验。仅仅参加（看）是不够的，操作人员（包括设备安装人员）必须执行他们在正常生产中会进行到的操作。应该确定无菌操作间可以最多容纳的操作人员数量（n+1）。当一个企业有多个班次工作时，第二个班次、第三个班次也应该包括在培养基灌装试验的计划中。包括班次的更换、暂停和必要的更衣。关键因素十:环境监测措施在培养灌装过程中，微生物监测（主动或被动的空气采样、设备表面、人员）以及悬浮粒子监测应该按照日常的操作程序进行。包括间隔期间和不同的人员。微生物监测程序的详细原则，包括取样点的选择、行动限和警戒线、方法学等可以参考PDA技术报告N0.13。工艺模拟实验中收集到的环境监测数据有利于建立和支持正常无菌操作区域的环境监测的行动限。关键因素十一:干预措施干预措施应该模拟实际运行时可能发生的情况；培养基灌装记录中应该记录所有发生的干预措施，以及被移走产品的数量。常规的干预措施：对于无菌生产线的安装、拆卸和连接，如果已经灭菌的部件脱离保护措施而被安装的话，是一个潜在危险。因此，开始灌装的容器更容易反映出无菌设备装配的潜在问题（注：如果正常生产过程中开始会有部分产品丢弃的话，可以不进入培养计数，但是也可以进行培养，能提供额外的信息）。其它的常规干预措施：胶塞供给，移走掉落的玻璃瓶,移走堵塞的胶塞，人员的停顿，换手套，环境的监测。非常规的干预措施（意外发生）：玻璃瓶破裂，灌装针头的更换或重新安装，装量调整的干预，传感器故障，传输带的调整等。关键因素十二:容器的检查任何灌装的产品都应该在培养前进行检查，发现任何不合格品（如容器密封性存在问题或完整性不好）时，都应该被剔除并记录。（还包括检查后被损坏的如向培养箱中转移的过程中）模拟过程最好有全程录像，瓶子或托盘应编号，阳性样品可追溯。每个瓶子都要目视检查，阳性的样品应别标记并移出培养箱。破损的样品不应包括在对无菌工艺能力的评价中。但破损的来源应被调查和纠正。关键因素十三:可接受标准新版GMP第四十八条：培养基模拟试验的目标是不出现长菌，且遵循以下原则：灌装少于5000支时，不应检出污染品；灌装在5000至10000时：有1支污染需进行调查，并考虑重复培养基灌装试验 2支污染需进行调查，并可即视作再验证的理由灌装超过10000支时：1支污染需进行调查 2支污染需进行调查，并可即视作再验证的理由发生任何微生物污染时，均应进行调查。关键因素十四:污染调查污染调查（1/9）调查的范围应包括 环境微生物监测数据，空气悬浮粒子监测数据 CIP设备，清洁、消毒程序的执行情况 培养基、设备和零件的灭菌工艺，灭菌釜的校正情况 高效过滤器检测(空气悬浮粒子水平，过滤器检漏，风速测量，密封系统检查，使用年限等)除菌过滤器完好性 房间气流形式与压差 人员操作技术培训情况关键因素十四:污染调查污染调查（2/9）调查的范围还应包括 以往产品无菌检查实验结果 人员卫生状况监测数据 培养基灌装实验中的干预方式分析 该区域近期是否有过维修活动，生产线的改造情况 该生产线培养基灌封实验历史数据 已灭菌物品的储存条件 培养基灌封过程中的异常事件 阳性污染菌与环境监测污染菌的鉴别关键因素十四:污染调查污染调查（3/9）调查结论与风险评估一、培养基灌封实验结果有效暂停生产，直至确定污染来源并采取有效的纠偏措施。再验证合格后，产品方可放行。对培养基灌封试验后和此前所生产的产品，进行风险评估，包括对已经放行批次的影响 二、培养基灌封实验结果无效实施适当的纠偏措施和预防措施后重新进行培养基灌封实验 条件1无菌灌装区的物理条件不满足要求 条件2人员未按照正常生产程序操作关键因素十四:污染调查污染调查（4/9）不管试验的数量，被污染的产品数量都应该是零。调查前的准备工作：录像资料、瓶子或托盘的编号等。发生失败(污染)时，必须确定最根本的原因，或者至少是最可能的原因。如有能力应对微生物进行分离和鉴别（鉴鉴定到种定到种）。关键因素十四:污染调查污染调查（5/9）污染污染 率率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)l在灌装过程中污染率上升 这表明污染可能来源于液体培养基(如与培养基贮罐非无菌连接，在循环管路中受到污染)。很重要的是，在灌装结束后，保持培养基贮罐处于无菌状态，当等到培养基灌装结束时，可以核实这样的假设。关键因素十四:污染调查污染调查（6/9）污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)l在灌装过程中污染率下降这表明污染发生于生产设备中（胶塞容器/轨道,计量泵/针头)，在灌装过程中“污染被部分或全部。”清洗掉关键因素十四:污染调查污染调查（7/9）污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)l在灌装过程中污染率出现尖峰一个尖峰（在短时段的一些产品被污染）可能与在灌装过程中不正确操作导致的关键失误有关。对于这个原因，很关键的是必须知道被污染产品灌装的准确时间，以及当时实施的干预措施（灌装操作过程的录像是非常有用的）关键因素十四:污染调查污染调查（8/9）污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)l污染率出现尖峰后，呈上升趋势 与前面的例子相同，但如果错误的干预措施能够影响到液体的管路/回路时（如培养基贮罐的变化，泵或针的替换）关键因素十四:污染调查污染调查（9/9）污染率污染率灌装过程灌装过程(时间或灌装量时间或灌装量)l孤立事件(试验中少数污染)不幸的是，这些现象是最普通的，也是最难调查的。如果这种现象在多次试验中反复出现，可能说明这环境噪“个工艺存在，所以需要根本”声的措施（如 更衣/着装、消毒剂和气流模式的改变)冻干制剂对培养基灌封的要求 一般从药液除菌过滤或灭菌开始，到完成无菌灌装，进行部分冻干程序，然后轧盖。培养基灌封冻干模拟步骤：容器内灌封好培养基，以半压塞状态装入冻干机冻干机内部分抽真空，在室温放置一定的时间，不得冷冻。用无菌空气破空（不使用惰性气体，除非在日常监测甚至产品中发现了厌氧菌时，可以使用惰性气体和厌氧培养基），全压塞，轧盖。注意，应采用透明容器，如果所使用的容器透明度不高，应将内容物倒出进行检查。粉针剂对培养基灌封的要求（1/3）第一种方法 在灌装线上直接灌装液体培养基，灌装后压塞-轧盖或熔封。优点：不需要增加液体灌装头，不需要增加额外的对照培养基。缺点：有些灌装设备无法做到；灌装速度与实际不同。粉针剂对培养基灌封的要求（2/3）第二种方法先粉末灌装（干粉培养基或惰性粉末），然后在线或离线液体（注射用水或液体培养基）灌装。（或者顺序颠倒过来）优点：没有缺点：额外的灌装需验证和做一定数量的液体阴性对照注：所用惰性剂、干粉培养基和注射用水需无菌。干粉培养基的流动性是的难问题。粉针剂对培养基灌封的要求（3/3）第三种方法非无菌液体灌装（注射用水或液体培养基），灭菌，在线的粉末灌装（干粉培养基或惰性粉末）。优点：不受设备的限制缺点：灭菌后敞口的瓶子的转移存在被污染的风险；需做一定数量的液体阴性对照。注：常用惰性粉末有聚乙二醇8000、羧甲基纤维素、乳糖。惰性粉末的抑菌性问题。方案的执行与记录（方案的执行与记录（1/2）培养基灌封的日期和时间使用的房间和设备容器胶塞的型号和尺寸培养基种类和灭菌方式每容器中的灌装体积灌装速度灌封的瓶数，灯检丢弃的瓶数和原因培养的瓶数，阳性的数量培养时间和温度方案的执行与记录（方案的执行与记录（2/2）环境监测的数据参与培养基灌封的人员培养基灵敏度检查的结果有无阳性结果。如有，要给出微生物鉴定的结果。如发生异常情况，需给出调查报告。培养基灌封实验的总结报告最终报告中应包括以下内容 模拟的最差条件 事件表 环境监测报告 微生物鉴别结果 培养基的营养检查实验结果 培养条件、结果读取日、结果读取人、每位参与者的灌装瓶数等信息。结论（结果是否可以接受）合格证书 工艺验证/再验证合格证书 人员资格确认证书结论结论即使一个公司培养基灌装试验是阴性的，也不能完全说明所有产品都没有被污染，因为培养基灌装试验要求的频率太小，没有统计意义。一个可靠的培养基灌装试验对于工艺验证是十分必要的步骤。必须实施全面质量保证（HVAC确认、清洗程序、卫生管理、个人培训)，培养基灌装试验只是其中的一部分。参考资料参考资料FDA CGMP 无菌工艺药品指南（2004年版）EU GMP 附件1 无菌药品的生产（2008年2月新版）新版GMP规范 附录1无菌药品PDA Technicial Report No.22 无菌灌装产品的工艺模拟实验WHO GMP 指南 技术报告 series n.937PIC/S Recommendations PI 007-5PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology Technical Report NThank you!