毕业设计-hla一dpa13-utr单核营酸多态与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性研究.doc

HLA一DPA13’UTR单核营酸多态与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性研究

【立项依据】：
人类白细胞抗原(humanleueoeyteantigens，HLA)作为免疫应答的重要基因群，与抗HBV免疫反应及HCC的发生均有着密切的关系。HBV感染已成为重要的全球性公共卫生问题，预计全球1/3的人口感染过HBV。感染HBV后机体会出现不同的疾病转归，大部分可自愈，其中约5%发展为慢性感染，如慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB），肝硬化（liver cirrhosis, LC）及原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HBV感染的致病机理较复杂，遗传因素在HBV致病过程中起到了重要的作用，而广泛存在于基因中的基因多态性，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）可导致机体对各种慢性损伤的反应具有明显的个体差异，影响疾病的易感和不同的疾病转归。HLA复合体是首次发现的与疾病有明确关系的遗传系统。而HLA与疾病的关联主要取决于其丰富的基因多态性。尤其是HLAll类基因多态性。最新的针对日本和泰国人群中的研究已经证实位于HLA一D队1基因3’UTR单核营酸多态rs3077刀G与慢性乙型肝炎有关。尽管HBV持续慢性感染机制、与HCC的关系以及HCC自身发生机制尚未明确，但机体对病原微生物或肿瘤抗原的免疫反应无疑在疾病进展过程中起关键作用。
HLA的主要生物学功能是提呈蛋白质抗原。主要与T细胞免疫有关，由于抗原必须在细胞表面展示，才能被T细胞识别，HLA的作用就是将内源性或外源性抗原以HLA一肤复合物的形式，通过T细胞表面的TCR，传递给CD4+和CDS+T细胞，以激活T细胞产生免疫。同时，它通过影响T细胞在胸腺内的发育而塑造个体的细胞库(与免疫耐受有关)，通过影响对抗原肤的选择性结合和提呈而控制适应性免疫应答。HLAI类分子主要参与内源性抗原的提呈，HLAll类分子主要参与外源性抗原的提呈，但也存在交叉提呈现象。
而HLA与疾病的关联主要取决于其丰富的基因多态性。HLA基因多态性一方面决定了HLA分子所能递呈抗原肤的基序，另一方面影响T细胞对抗原的识别。从而造成不同HLA分子结合和提呈抗原肤能力的差异。使得不同的HLA基因对疾病的易感性不同，对同一抗原的免疫应答强度也不同，进而导致疾病转归不同，使其成为可能影响HBV感染慢性化及HCC发生的主要因素之一，这也是HLA以多态性参与调控对HBv及HCc免疫应答的重要机制。
最近的一篇报道来自Kamatani和其同事[20]实施的一组针对日本和泰国人群的HBV持续感染和基因变异的全基因组关联研究，起始的基因体关联分析比较慢性HBV感染日本病患(共 179位)与健康个体(共934位)，研究中P值最小的的单一核普酸基因多态性(SNPS)，再进一步与607位独立的HBV感染与 1267位对照组个体身上确认，共找出一1个显著与慢性HBv感染有关的sNPS(P值=3.62Xlo一8到1.16xlo一，3)。这11个SNPS都位于或接近HLA一DPAI与HLA一DPBI基因。重新检验以 1300例患者和2100例对照者为研究对象的两项日本和一项泰国队列研究中，进一步确认了与慢性HBV感染有关的两个SNPs，HLA一DPAI基因rs3O77A/G与HLA一DPBI基因rs9277535A/G(复合P值分别为 6.34x10一3，和 2.31x10一38，OR=0.57和0.56)。这两个区域的G等位基因与慢性感染有关，而A等位基因则与保护力有关。研究者推测这些基因可能会导致HLA一DP分子抗原提呈效应从而导致HBv持续感染。2010年8月，Hongxing Zhang等报道了一项中国人群的GWAS研究结果，位于人类染色体1p36.22的KIF1B基因的rs17401966位点与HBV相关肝癌有关，该位点是否在HBV感染不同结局及药物治疗预后中同样存在相关性。2011年7月，一项来自日本的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）发现，HLA-DQ基因的SNP位点rs2856718与CHB有关；Vinod Kumar等，报道了一项GWAS研究结果，HLA-DQ基因的SNP位点rs9275572与丙型肝炎病毒相关性肝癌有关，该位点是否与HBV感染同样具有相关性，在中国人群中是否存在这种关联，是否与抗病毒药物治疗预后相关，尚未见相关报道。此外，有实验研究发现了与HBV感染结局相关的差异蛋白-真核肽链释放因子GTP结合亚单位（eRF3b），它是由GSPT2基因编码，它与eRF3a（由GSPT1编码，与eRF3b高度相似，87%的氨基酸序列相同）共同参与中止真核生物蛋白合成的过程。前期，进行了关于这两种蛋白与HBV感染的功能学研究，即将探讨GSPT1和GSPT2基因的两个SNP位（rs33635和rs974285）与HBV感染及治疗预后的相关性。实验结果显示：1HLA-DQ多态性位rs2856718与HBV感染及其结局的关系在共显性模型下，携带rs2856718AGrs2856718GG基因型的个体感染HBV的风险降低，OR值分别为0.738和0.4（95%CI=0.571-0.954,P=0.020；95%CI=0.331-0.636, P＜0.001）；在显性模型（GG+AG vs AA）和隐性模型（GG vs AA+AG）下，OR值分别为0.641和0.541（95%CI=0.505-0.814, P＜0.001；95%CI=0.403-0.725, P＜0.001）；吸烟和饮酒均为HBV感染的独立危险因素（OR=1.688, P=0.006；OR=1.507,P=0.001）；rs2856718与HBV自然清除相关，在共显性模型下，rs2856718与HBV自然清除有关联，携带rs2856718AG和rs2856718GG基因型的个体HBV自然清除能力强（AG vs AA, OR=0.642,95%CI=0.479-0.773,P=0.003; GG vs AA, OR=0.528,95%CI=0.361-0.773, P=0.001）；在显性模型下，rs2856718GG+AG基因型携带者HBV自然清除能力更强，发展为HBV慢性感染的可能性为rs2856718AA基因型携带者的0.610倍（95%CI=0.463-0.805, P＜0.001）；在隐性模型下，rs2856718GG基因型携带者HBV自然清除能力强，发展为HBV慢性感染的可能性为rs2856718AA+AG基因型携带者的0.688（95%CI=0.492-0.962,P=0.029）；吸烟为HBV感染的独立危险因素（OR=1.512,95%CI=1.009-2.264, P=0.045）。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与HBV感染及其结局的关系rs9275572与HBV易感性有关联。在共显性模型下，携带rs9275572AG或rs9275572AA基因型的个体感染HBV的风险降低，OR值分别为0.706和0.374（95%CI=0.553-0.903, P=0.006；95%CI=0.244-0.573, P＜0.001）；在显性模型（AA+AG vs GG）下和隐性模型（AA vs GG+AG）下，OR值分别为0.627和0.429（95%CI=0.498-0.790, P＜0.001；95%CI=0.283-0.650, P＜0.001），吸烟和饮酒均为HBV感染的独立危险因素（OR=1.635, P=0.002; OR=1.582, P=0.002）。rs9275572与HBV的自然清除相关，在共显性模型下，携带rs9275572AG基因型的个体HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的0.719倍（95%CI=0.544-0.949, P=0.020）；在显性模型下，携带rs9275572AA+AG基因型的个体HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的为0.714（95%CI=0.547-0.932, P=0.013）；吸烟是HBV自然清除的独立危险因素（OR=1.527,95%CI=1.022-2.282, P=0.039）。3GSPT多态性位点rs33635和rs974285与HBV感染及其结局的关系本研究尚未发现rs33635和rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC进展和HCC进展的相关性。4KIF1B多态性位点rs17401966与HBV感染及其结局的关系本研究发现rs17401966基因多态性与HBV自然清除有关联，携带rs17401966GG基因型的个体HBV自然清除的可能性更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs17401966AA基因型携带者的0.568倍（95%CI=0.361-0.894, P=0.015）；rs17401966基因多态性与HBV易感性、LC进展及HCC进展无关联。5基因-基因交互作用经MDR分析，在HBV易感性研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718、 rs9275572）、 GSPT1位点（rs33635）和KIF1B位点（rs174019664）之间的交互作用（P=0.0010），高危组合易感风险为低危组合的2.643倍（95%CI=1.458-3.487）。在HBV自然清除研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718、rs9275572）、GSPT1位点（rs33635）和KIF1B位点（rs174019664）之间的交互作用（P=0.023），与HBV自然清除的关联强度为2.024（95%CI=1.156-3.958）。在LC进展和HCC进展研究中均未发现基因-基因间的交互作用。6基因-环境交互作用经MDR分析，在HBV易感性研究中，准确性和交叉检验一致性最高的因子模型为HLA-DQ位点（rs9275572）、吸烟和饮酒的交互作用（P=0.0010），高危组合易感风险为低危组合的3.014倍（95%CI=1.647-4.963）。在HBV自然清除研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718）和饮酒的交互作用模型（P=0.0010），与HBV自然清除的关联强度为1.923（95%CI=1.185-4.032）。在LC进展研究中，未发现有统计学意义的基因-环境交互作用模型。在HCC进展研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718）、GSPT1位点（rs33635）、KIF1B位点（rs17401966）和吸烟间的交互作用（P=0.0110），高危组合易感风险为低危组合的1.847倍（95%CI=1.265-3.468）。研究拟探讨HLA-DQ （rs28567185和rs9275572）、GSPT（rs33635和rs974285）及KIF1B（rs17401966）五个候选基因与LAM治疗后不同结局的相关性。方法：选择符合条件的研究对象354例，以问卷形式收集研究对象的一般情况，并收集外周血，提取DNA，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight MassSpectrometry，MALDI-TOF MS）实验平台进行DNA的SNPs分型。经LAM治疗6个月后，根据病毒学应答（DNA载量＜3log copies/ml或下降＞2log copies/ml）与否分为两组（DNA应答组与DNA非应答组），根据生化学应答（治疗后ALT在正常参考值范围）分为ALT应答组和ALT非应答组。先进行单因素分析，再用非条件Logistic回归分析校正混杂因素，分析SNP位点与HBV易感性及其感染结局的关联，并用多因子降维法进行基因-基因和基因-环境之间的交互作用分析，由SPSS16.0统计软件、MDR2.0及MDRPT V0.4.6完成数据分析。结果：1HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答及ALT应答的关系rs2856718与DNA应答无关联，但与ALT应答具有相关性，rs2856718A等位基因更容易出ALT应答，在共显性模型下（GG vs AA），OR值为2.458（95%CI=1.277-4.730，P=0.007）；在显性模型（GG+AG vs AA）和隐性模型（GG vs AA+AG）下，OR值分别为1.691（95%CI=1.093-2.615，P=0.018）和2.040（95%CI=1.104-3.772，P=0.020）；性别是ALT应答的独立影响因素，男性ALT应答率低于女性，年龄、吸烟及饮酒与ALT应答无关联。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及ALT应答的关系rs9275572与DNA应答相关，rs9275572G等位基因更容易出DNA应答，共显性模型（AG vs GG: OR=2.062,95%CI=1.153-3.687，P=0.015; AAvs GG: OR=5.553,95%CI=1.827-16.877，P=0.003）、在显性模型下（AA+AG vs GG: OR=2.599,95%CI=1.525-4.428，P＜0.001）和隐性模型下（AAvs GG+AG: OR=4.684,95%CI=1.552-14.133，P=0.006）均具有相关性；男性患者拉米夫定治疗后DNA应答的可能性较女性低。rs9275572基因多态性与ALT应答具有相关性，rs9275572G等位基因更容易出ALT应答，在共显性模型下（AG vs GG: OR=2.037,95%CI=1.231-3.369, P=0.006; AA vs GG: OR=3.245,95%CI=1.415-7.440,P=0.005）、在显性模型下（AA+AG vs GG: OR=2.279,95%CI=1.442-3.602,P＜0.001）和隐性模型下（AA vs GG+AG:OR=2.678,95%CI=1.182-6.068,P=0.018）均存在此关联；性别与ALT应答相关，男性LAM治疗后的ALT应答的可能性低于女性（OR=0.509,95%CI=0.297-0.872,P=0.014），年龄、吸烟和饮酒与ALT应答均无相关性。3GSPT1多态性位点rs33635与DNA应答及ALT应答的关系rs33635C等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显性模型下（CCvs TT），rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性为rs33635TT基因型携带者的2.449倍（95%CI=1.057-5.674, P=0.037）；在隐性模型下（CCvs TT+CT），rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性为rs33635TT+CT基因型携带者的2.551倍（95%CI=1.138-5.716, P=0.023）；性别为DNA应答的独立影响因素，男性DNA应答的可能性降低。在共显性模型（CC vs TT）和隐性模型下（CC vs TT+TC），rs33635C等位基因携带者更易发生ALT应答（OR=3.587,95%CI=1.727-7.450,P=0.001; OR=3.840,95%CI=1.910-7.720, P＜0.001）；性别与ALT应答相关，男性患者ALT应答的可能性均降低。4GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的关系尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的相关性。5KIF1B多态性位点rs17401966与DNA应答及ALT应答的关系rs17401966与DNA应答具有相关性，rs17401966G等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显性模型下（AG vs AA），OR值为3.141（95%CI=1.826-5.403, P＜0.001），在显性模型下（GG+AG vsAA）， OR值为3.483（95%CI=2.045-5.932, P＜0.001）；在隐性模型下（GG vsAA+AG），OR值为5.350（95%CI=1.176-24.347, P=0.030）；性别、年龄为DNA应答的独立影响因素，吸烟和饮酒对DNA应答无影响。rs17401966G等位基因携带者更易发生ALT应答，在共显性模型（AGvs AA）和显性模型（GG+AG vs AA）下，rs17401966与ALT应答具有相关性（OR=1.941,95%CI=1.231-3.063, P=0.004; OR=1.687,95%CI=1.089-2.615, P=0.019）；性别是ALT应答的独立影响因素，年龄、吸烟及饮酒对ALT应答均无影响。第三部分HLA-DP基因多态性与HBV感染的Meta分析目的：采用Meta分析的方法，对国内外不同人群的研究结果进行综合评价，以证实HLA-DP基因的rs3077和rs9277535两个SNP位点是否与HBV感染及HBV自然清除有关。方法：以“rs3077”为检索词，检索中国生物医学文献数据库、中国学术期刊全文数据库及Pubmed数据库。共检索到7篇文献，以“rs9277535”为检索词，共检索到8篇文献，经过仔细阅读，共8篇文献纳入meta分析，其中，有两篇文献分别包括4个阶段的研究数据，共获得16个亚组数据，有12个亚组数据用于rs3077位点的meta分析，14个亚组数据用于rs9277535位点的meta分析。提取纳入文献的信息如下：第一作者、出版年、研究设计类型、受试者来自的国家和种族、病例组和对照组的定义和数量、提取DNA和分型的方法。文献未提供等位基因频率的，利用相应的基因型计算，分别提取rs3077和rs9277535位点的相关数据，本研究对rs3077和rs9277535位点的等位基因、共显性模型、显性模型及隐性模型进行了meta分析。计算优势比（OR）及其95%CI作为效应量。首先对纳入分析的原始文献进行Q检验，分析异质性，根据异质性检验结果，选择固定效应模型或随机效应模型求其效应合并值。用漏斗图和Egger’s检验进行发表偏倚分析，以P<0.05为差异有统计学意义。所有数据用STATA10.0分析。结果：1HLA-DPA1rs3077与HBV感染及HBV自然清除的关系经meta分析，结果表明，携带HLA-DPA1rs3077A等位基因为HBV感染的保护性因素（OR=0.556，95%CI=0.527-0.586, P＜0.001），携带HLA-DPA1rs3077A等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DPA1rs3077G等位基因个体的0.556倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG, OR=0.522，95%CI=0.485-0.561, P＜0.001；AAvsGG, OR=0.350，95%CI=0.311-0.393, P＜0.001；GA+AAvsGG,OR=0.478，95%CI=0.446-0.513, P＜0.001；AAvsGA+GG, OR=0.480，95%CI=0.429-0.536, P＜0.001）。携带HLA-DPA1rs3077A等位基因的个体感染HBV后自然清除的可能性高，发展成CHB的可能性降低（OR=0.654，95%CI=0.611–0.701, P＜0.001），为携带HLA-DPA1rs3077G等位基因个体的0.654倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG, OR=0.636，95%CI=0.577-0.702, P＜0.001；AAvsGG,OR=0.446，95%CI=0.383-0.520, P＜0.001；GA+AAvsGG, OR=0.595，95%CI=0.542-0.652, P＜0.001； AAvsGA+GG, OR=0.565，95%CI=0.489-0.652, P＜0.001）。2HLA-DPB1rs9277535与HBV感染及HBV自然清除的关系meta分析结果表明，携带HLA-DPA1rs9277535A等位基因为HBV感染的保护性因素（OR=0.582，95%CI=0.556-0.609, P＜0.001），携带HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的0.556倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG, OR=0.542，95%CI=0.506-0.579, P＜0.00；AAvsGG, OR=0.371，95%CI=0.336-0.409, P＜0.00；GA+AAvsGG,OR=0.493，95%CI=0.462-0.525, P＜0.001；AAvsGA+GG, OR=0.516，95%CI=0.472-0.564, P＜0.001）。携带HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体HBV自然清除的可能性高，发展成CHB的可能性降低（OR=0.663，95%CI=0.626-0.702, P＜0.001），为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的0.663倍；在共显性模型、显性模型及隐性模型中结果相同（AGvsGG,OR=0.623，95%CI=0.570-0.681, P＜0.001；AAvsGG, OR=0.464，95%CI=0.412-0.523, P＜0.001；GA+AAvsGG, OR=0.577，95%CI=0.531-0.628,P＜0.001；AAvsGA+GG,OR=0.430，95%CI=0.390-0.474, P＜0.001）。
第一部分研究显示： 1在中国北方汉族人群中，HLA-DQ的两个SNP位点（rs9275572和rs2856718）与HBV的易感性，HBV自然清除及HBV感染后的相关疾病进展有关。rs9275572A和rs2856718G为HBV感染的保护性因素，在HBV自然清除、LC进展和HCC的进展中起到保护作用。2KIF1B rs17401966基因多态性与HBV自然清除有关联，携带rs17401966GG基因型的个体HBV自然清除的可能性更高，与HBV易感性、LC进展及HCC进展无关联。3本研究未发现GAPT1rs33635和GAPT2rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC和HCC进展的相关性。4吸烟和饮酒均为HBV感染、HBV自然清除的独立危险因素；年龄越大，越容易由CHB进展到LC和HCC；男性、高龄及饮酒为HCC进展的独立危险因素；在HBV易感性、HBV自然清除及HBV感染不同结局中，存在基因-基因和基因-环境的交互作用。第二部分研究发现：1HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答无关联，与ALT应答具有相关性，rs2856718G等位基因可能为ALT应答的保护性碱基。性别是DNA应答和ALT应答的独立影响因素，女性更容易出现DNA应答和ALT应答。2HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及ALT应答有关，rs9275572A等位基因携带者DNA应答和ALT应答的可能性增高，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素。3GSPT1rs33635C等位基因是DNA应答和ALT应答的保护性因素，女性DNA应答和ALT应答的可能性更高。4尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的关联。5KIF1B rs17401966G等位基因为DNA应答和ALT应答的保护性碱基，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素。6经MDR分析，LAM治疗后的DNA应答和ALT应答不仅受到遗传因素的影响，同时又受到环境因素的影响，并存在基因-基因和基因-环境之间的复杂的交互作用。后面研究发现：1通过meta分析证实，携带HLA-DPA1rs3077A等位基因是HBV感染的保护性因素，携带此等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带rs3077G个体的0.556倍；而且还证明HLA-DPA1rs3077A等位基因为HBV自然清除的保护性因素，携带该等位基因的个体HBV自然清除的可能性更高。2通过meta分析证实，HLA-DPA1rs9277535A等位基因也是HBV感染和HBV自然清除的保护性因素，携带该等位基因的个体感染HBV的风险降低，为携带HLA-DPB1rs9277535G等位基因个体的0.556倍；携带HLA-DPB1rs9277535A等位基因的个体HBV自然清除的可能性更高，发展成CHB的可能性降低。
目前由于关于HLAll类基因单核甘酸多态性与HCC易感性的报道仍然比较缺乏。但由于HBV持续感染和HCC有着明确的相关性，可以推测与HBV感染有关的多个SNP可能与HCC的发生也有相关性;另外，HCC一旦在机体内发生发展，机体的免疫系统可能通过多种途径参与抗肿瘤的免疫效应，以消除肿瘤细胞或控制肿瘤的生长，这其中也包括HLAll类分子所参与的对HCC细胞相关抗原的加工、处理和提呈及其他抗肿瘤机制，因此推测HLAll类基因的单核甘酸多态性同样对HCC的发生、发展以及转移有着至关重要的作用。
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【研究方案】：
１． 【研究目标】：
通过大样本量的病例一对照，以SNP为遗传标记，研究HLA一DPAI基因rS3O77A/G与慢性HBV感染及HCC的发病风险的关系。

２.【研究内容】：
1). 在中国人群中对rs3077刀G与慢性乙型肝炎的遗传易感性进行验证;
2). 研究该多态与慢性HBV感染不同结局的关系;
3). 对该基因多态与HCC的遗传易感性进行分析;
4). 探讨该基因多态可能的作用机制。

３. 【研究方法】:
一、应用聚合酶连反应(polymerase chain reaction,PCR)和限制性片段长度多态性（restrition fragmeng length polymorphism,RFLP）,检测了417例慢性乙型肝炎患者、402例无症状慢性HBV携带者、453例肝癌患者以及表面抗原阴性的729例正常人群的rs3O77多态，比较不同基因型与上述疾病风险的关系。

４.【技术路线】：
　１. 将所有研究对象分为四组：正常对照组，慢性乙型肝炎组，无症状慢性HIV携带者组，肝癌组。每个研究对象均捐献外周静脉血2ml以获取基因组DNA用于基因型分析。
　２. 基因组DNA的提取(酚一氯仿抽提法):
　　基因组DNA用蛋白酶K和饱和酚一氯仿常规方法提取。将收集的抗凝血标本从－20oc取出，置室温融化后转入另一洁净离心管，于5000xg离心巧min:弃上清，在下层血细胞中加入适量DNA裂解缓冲液(含 10mMpH8.0Tris一HCI，0.IMEDTA，20拼目mL胰RNA酶，0.5%SDS)，充分混匀后置37℃水浴lh，加入蛋白酶K(终浓度为100协留mL)，混匀后于37℃水浴过夜;加入等体积Tris一HCI平衡的饱和酚 (pH7.4)，充分混匀后于 8000xg离心巧min;转移上层水相至另一洁净离心管，加入等体积饱和酚:氯仿(1:1)，混匀后 8000xg离心巧min;转移上层水相至另一洁净离心管中，加入10%体积的乙酸钱溶液(10M)和2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后置一 20oCZh;捞出沉淀的DNA并用75%乙醇洗涤两次，溶于适量Tris一EDTA(TE)缓冲液(含 10mMTris一HCI， 1mMED认， pH8.0):用紫外分光光度计测定DNA纯度及浓度。
３. HLA一DPAI基因型分析
　　 以蛋白酶K和饱和酚一氯仿常规方法提取基因组DNA。HLA-DPAI基因的单核普酸多态的基因型均以PCR扩增产物的限制性片断长度多态性 (PCR一RFLP)方法确定，具体描述如下:
(1) PCR引物:扩增HLA-DPAI基因的3’-UTR区含T/C多态的引物为rs3077F５’-GGA CTT AGG AGA GAT CTG AAC TCC A一3‘和rs3O77RS‘一 TCA GCA ATT CAG TCA GCC ACT CG一3’，产物为102bp，其中rs3o77R引物的3’端的倒数第二个C为错配碱基。
(2) PCR条件:25ul反应体系中含100ng模板DNA，0.1uM各引物， 0.2mMdATp、dGTp、dCTp和dTTp混合液，1UTaqDNA聚合酶及其l\Gel反应缓冲液。热循环条件为:95摄氏度预变性 2min，然后94摄氏度30sec，60摄氏度30Sec，72摄氏度30Sec，39个循环后72摄氏度延伸10min。
(3) 基因型分析:限制性核酸内切酶XhoI(New England Biolabs，Ipswich，MA)用于T__C多态的基因型分析。酶切在10ul反应体系中进行,其中含8ulPCR产物、1乘以反应缓冲液和6U相应核酸内切酶。将反应混合液置37摄氏度水浴10h，限制性酶切产物在3.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶图像分析系统GDS一 8000(UVP， USA)分析电泳图谱，判断各基因型。T等位基因含一个双oI酶切位点，而C等位基因不含XhoI酶切位点，因此ＣＣ基因型只有一个 102bp片段，而TT基因型有78bp和24bp的两个片段，TC杂合子基因型有IOZbp、78bv和24bp的三个片段。
为保证基因分型的可靠性，基因分型实验在不知道标本是病人还是对照的情况下进行。此外，我们随机挑选15%标本，由另一实验者进行重复检测，结果与第一次分析结果完全一致。同时，作为二等位多态，本研究中尽管针对T/C进行基因分型，由于文献中多以其互补链上的A/G对其多态进行描述，我们采取同样的方法。

　统计分析：组间频率的单因素分析如年龄、性别以及等位基因频率等以x２才检验比较。以非条件Logistic回归模型，对年龄和性别进行校正后，计算比值比(odds ratios，ORs)及其95%可信区间 (Cls)及基因型差异的Ｐ值。所有统计检验均为双侧概率检验，以P<0.05为统计学显著性差异标准。所用统计软件为StasticAnalysis system6．12版 )。同时计算正常对照组的基因型频率是否符合Hardy一Ｗeinberg平衡定律。

5. 【预期成果】：
rs3077多态位点的基因型在病例组和对照组间的分布符合Hardy一Weinberg平衡定律。rs3O77一A等位基因显著降低了慢性乙型肝炎的发病风险，且呈等位基因一剂量效应。进一步分析显示，该等位基因同样降低了无症状HBV携带者、HBsAg阳性的肝癌及总体肝癌的发病风险，且同样呈等位基因一剂量效应。然而，该等位基因与HBsAg阴性的肝癌发病风险不相关，也与无症状HBV携带者进展为肝癌的风险无明显相关性，却反而促进了慢性乙型肝炎进展为肝癌的发病风险。

6. 【研究计划】：1）订购实验材料及试剂如：Tris碱,SDS ，胰RNA 酶，Taq DNA 聚合酶，
dNTP ，Xhol，琼脂糖；准备相关实验仪器。
2) 选择合适的研究对象，包括正常对照者、慢性乙型肝炎患者、无症状
慢性HIV携带者、肝癌患者，收集血标本保存待用于检测。
3）基因组DNA的提取(酚一氯仿抽提法)，及进行HLA一DPAI基因型分
析。
4）进行统计学分析。

7. 【实验条件与基础】：
　实验条件：
　　主要试剂有：Tris碱,SDS ，胰RNA 酶，Taq DNA 聚合酶