植物花药和花粉培养.ppt
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1、第七章 植物花药和花粉培养第一节 植物花药和花粉培养的概念和应用一、花药和花粉培养的概念花药:植物花的雄性器官,包括二倍性的花药:植物花的雄性器官,包括二倍性的组织和单倍性的雄性性细胞。组织和单倍性的雄性性细胞。花粉:由花粉母细胞经过减数分裂形花粉:由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞。成的单倍体的生殖细胞。药壁和药隔组织(2n)花粉粒(n)花粉粒的形成:花粉母细胞花粉母细胞(小孢子母细胞)(小孢子母细胞)减数减数分裂分裂4 4个小孢子个小孢子(四分体时期)(四分体时期)进入进入单核期单核期1 1个小孢子个小孢子有丝有丝分裂分裂花花粉粉粒粒花粉管细胞核花粉管细胞核生殖细胞核生殖细胞核
2、营养细胞营养细胞双双核核期期生殖细胞生殖细胞精子精子指指在合成培养基上,改变花粉的正常发育在合成培养基上,改变花粉的正常发育途径,使其不形成配子,而像体细胞一样途径,使其不形成配子,而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株进行分裂、分化、最终发育成完整植株。花药和花粉培养该发育途径被称为该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径花粉孢子体发育途径”或或“雄核发育雄核发育”。花粉和花药培养的异同点:共同点p培养目的相同:培养目的相同:均获得单倍体植株均获得单倍体植株p花药培养属于器官培养;而花药培养属于器官培养;而花粉培养属于细胞培养。花粉培养属于细胞培养。p花粉培养没有药壁组织干扰;花粉培养
3、没有药壁组织干扰;可计数小孢子产胚率;可观察可计数小孢子产胚率;可观察雄核发育的全过程;单倍体产雄核发育的全过程;单倍体产量高,但技术更复杂。量高,但技术更复杂。不同点缩短缩短育种周期:常规育种需育种周期:常规育种需4-64-6年获得纯系,而小孢子年获得纯系,而小孢子培养仅需一年。培养仅需一年。供体植株小供体植株小孢子(孢子(n n)花培花培花粉植株(花粉植株(n n)雄核发育雄核发育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍纯合纯合植株(植株(2n2n)一年内获得纯系一年内获得纯系二、花药和花粉培养的应用(一)作物育种(一)作物育种ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaB
4、BaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb2.提高了目标基因型的选择效率AaBbAAbb1/16单倍体方法单倍体方法3.诱变育种中的作用植株植株不受显隐性的影响,在诱变育种中能在当代及时不受显隐性的影响,在诱变育种中能在当代及时获得突变个体,加倍后成为稳定的纯系获得突变个体,加倍后成为稳定的纯系。可可探索亲本染色体组的构成探索亲本染色体组的构成。分析分析单倍体植物减数分裂时,形成二价体的单倍体植物减数分裂时,形成二价体的数目和形状,能确定染色体组内是否存在同源数目和形状,能确定染色体组内是否存在同源染色体。染色体。(二)物种进化研究 (三)遗传分
5、析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响,每一单倍体植株中基因不受显隐性的影响,每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。(四)构建连锁图谱 双单倍体群体双单倍体群体是永久性群体,能有效地用于是永久性群体,能有效地用于遗传图谱的构建。遗传图谱的构建。(五)用于遗传转化 能直接表达外源基因,不受显隐性影响。能直接表达外源基因,不受显隐性影响。第二节 花粉小孢子发育途径一、活体小孢子发育途径花粉发育时期对诱导雄核发育极其重要花粉发育时期对诱导雄核发育极其重要。花粉母细胞(花
6、粉母细胞(PMCPMC)减数分裂形成四分体,释放)减数分裂形成四分体,释放4 4个小孢子。小孢子第一次分裂为不均等分裂形成营养个小孢子。小孢子第一次分裂为不均等分裂形成营养核和生殖核;第二次有丝分裂仅限于生殖核,形成两核和生殖核;第二次有丝分裂仅限于生殖核,形成两个精子。个精子。花粉孢子体发育途径(雄核发育)胚性能力的获得胚性能力的获得细胞分裂的诱导细胞分裂的诱导胚状体的形成胚状体的形成二、离体小孢子发育途径(一)雄核发育途径最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。最适宜诱导的时期是第一次有丝分裂或之前。1.A1.A途径途径-小孢子小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂,第一次有丝分裂为不均等分裂,
7、形成营养细胞和形成营养细胞和生殖细胞生殖细胞(1)A-V途径 由营养细胞重复分裂形成多细胞花粉(或多核由营养细胞重复分裂形成多细胞花粉(或多核花粉);生殖细胞以游离核的形式存在一个周花粉);生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化,或分裂一至数次存在于多核花粉的期后退化,或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧,有的甚至到球形胚形成时仍存在。一侧,有的甚至到球形胚形成时仍存在。(2)A-G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体,营养细胞生殖细胞进行多次分裂形成胚状体,营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。(3)A-VG途径(E途径)花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分
8、裂,形成花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂,形成两类细胞群,各群的子细胞都类似其母细胞。两类细胞群,各群的子细胞都类似其母细胞。(4)C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合,形成非单倍营养细胞和生殖细胞通过核融合,形成非单倍体植株。在获得的花粉植株群体中,有二倍体、体植株。在获得的花粉植株群体中,有二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株。三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株。2.B途径 小孢子小孢子第一次有丝分裂为均等分裂,形成大小相第一次有丝分裂为均等分裂,形成大小相近的两个近的两个细胞(或游离核)。细胞(或游离核)。然后由这两然后由这两细胞细胞(或游离核)(或游离核)继续继续分裂形
9、成分裂形成单一类细胞组成的多单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。细胞花粉或多核花粉。小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径(二)雄核发育启动机理1.1.雄核发育雄核发育与与P P花粉的形成花粉的形成胚性花粉粒特点:胚性花粉粒特点:p核核位于花粉粒位于花粉粒中心;中心;p醋酸醋酸洋红压片观察,花粉粒着色较洋红压片观察,花粉粒着色较浅;浅;p有有液泡和液泡和2 2个清晰着色的核个清晰着色的核。P-P-花粉或花粉或E-E-花粉:具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉:具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉(花粉(S-S-花粉)或不染色花粉(花粉)或不染色花粉(NS-NS-花粉)。花粉)。2.雄核发育与
10、饥饿处理对花粉进行短期的饥饿处理,再供给发育所对花粉进行短期的饥饿处理,再供给发育所需营养,对花粉胚胎发生是非常重要的。需营养,对花粉胚胎发生是非常重要的。饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向,饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向,启动雄核发育。其机制可能是使本来停止在启动雄核发育。其机制可能是使本来停止在G G1 1期的营养核重新启动,开始期的营养核重新启动,开始DNADNA的复制和的复制和进一步发育。进一步发育。三、花粉植株形态发生方式花粉植株的形态发生途径:(一)胚状体发育途径一)胚状体发育途径 (直接发育途径)(直接发育途径)小孢子经历合子胚发生的各个阶段,最后小孢子经历合子胚发生的各
11、个阶段,最后子叶展开,形成花粉植株。子叶展开,形成花粉植株。(二)愈伤组织发育(二)愈伤组织发育途径(间接发育途径)途径(间接发育途径)小孢子分裂数次形成愈伤组织,愈伤组织小孢子分裂数次形成愈伤组织,愈伤组织再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。现变异且倍性复杂。三、花粉植株形态发生方式体细胞胚体细胞胚:植物组织培养过程中,某些体细胞:植物组织培养过程中,某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚(具胚根、在形态上转变为与合子发育成的胚(具胚根、胚芽、胚轴等结构)非常相似的结构,称作体胚芽、胚轴等结构)非常相似的结构,称作体细胞胚或胚状
12、体。细胞胚或胚状体。花粉胚:植物组织培养过程中,某些单倍体性花粉胚:植物组织培养过程中,某些单倍体性细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构,称作花粉胚或胚状体。似的结构,称作花粉胚或胚状体。胚状体发育途径胚状体发育途径烟烟草草花花药药培培养养部分花药通过胚状体途径形成小植株部分花药通过胚状体途径形成小植株胚状体发育途径胚状体发育途径芸苔属小孢子培养芸苔属小孢子培养球形胚球形胚 鱼雷形胚鱼雷形胚心形胚心形胚 辣椒小孢子胚胎形成过程(球形胚阶段后)辣椒小孢子胚胎形成过程(球形胚阶段后)a,b:球形胚,胚的表面粘连在花粉粒外壁上;c,d:心形胚;e,
13、f:鱼雷形胚愈伤组织发育途径愈伤组织发育途径水稻花药培养水稻花药培养接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株愈伤组织分化形成再生植株第三节 花药和花粉培养方法一、花药培养1.取材 镜检镜检,根据花粉的发育时期,选取大小适宜的,根据花粉的发育时期,选取大小适宜的花蕾。花蕾。2.消毒 7070酒精擦洗花蕾表面,或酒精擦洗花蕾表面,或7070酒精浸泡酒精浸泡30-60s30-60s后在后在1 1次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡10-20min10-20min或在或在0.10.1
14、的氯化汞溶液中消毒的氯化汞溶液中消毒3-10min3-10min,无菌水冲洗,无菌水冲洗3-53-5次次。3.培养 固体固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养,或液体培养基均可。先进行脱分化培养,至小孢子大量分裂形成胚或愈伤,并突破花药至小孢子大量分裂形成胚或愈伤,并突破花药壁表面,形成突出物(壁表面,形成突出物(2-32-3周);后转入分化培周);后转入分化培养基培养,形成小植株。养基培养,形成小植株。二、花粉培养(一)花粉的分离与纯化 1 1.自然自然散落法散落法(漂浮培养散落小孢子收集法漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上,待花将花药接种在预处理液或液体培养基上,
15、待花粉自动散落后,收集培养。粉自动散落后,收集培养。2 2.挤压挤压法法 在烧杯或研钵中挤压花药,将花粉挤出后收集在烧杯或研钵中挤压花药,将花粉挤出后收集培养。培养。3.3.机械机械游离游离 (1 1)磁搅拌法)磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药,使花用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药,使花粉游离出来;粉游离出来;(2 2)超速旋切法)超速旋切法 通过通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药,使小孢子游离出来(此法应用最穗子、花药,使小孢子游离出来(此法应用最广)。广)。4.4.小孢子小孢子纯化纯化 对对上述方法获得的小孢子混合物进行分级上述方法获得的小
16、孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子过筛、梯度离心处理纯化小孢子梯度离心梯度离心前前(小孢子形态、活力不一致)小孢子形态、活力不一致)30%30%蔗糖梯度离心后蔗糖梯度离心后(获得均一的小孢子群体)(获得均一的小孢子群体)(二)花粉培养方式 1 1.平板培养平板培养 花粉花粉置琼脂固化培养基上培养。置琼脂固化培养基上培养。2 2.液体液体培养培养 花粉花粉悬浮在液体培养基中培养,需震荡,以悬浮在液体培养基中培养,需震荡,以利通气。利通气。3 3.双层双层培养培养 花粉花粉置固体置固体-液体双层培养基上培养。培养液体双层培养基上培养。培养基制作方法:先铺一层琼脂固体培养基,凝固基制作方
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