(毕业论文)豆渣中大豆异黄酮的提取及其在面膜中的应用.doc

长春工业大学本科毕业论文摘要豆渣是豆制品加工的副产物，除了作饲料、肥料使用外，还有其他增值加工的方法。其中豆渣中富含的大豆异黄酮是非常有价值的成分。大豆异黄酮具有抗氧化的功能对皮肤组织有特殊的作用。从理论上讲，皮肤局部使用大豆异黄酮对延缓皮肤衰老比口服具有更好的作用，所以将大豆异黄酮制作成化妆品对延缓及抵抗皮肤衰老有较好的效果。本文对大豆异黄酮的提取工艺做了研究，并将大豆异黄酮用于美容面膜的制备，首先单因素试验确定浸提时间，浸提温度以及料液比对大豆异黄酮的提取率进行研究，并以大豆异黄酮的提取率和抗氧化性为评价指标，通过正交试验确定了大豆异黄酮提取的最佳工艺条件：即料液比为1:20，在50下浸提1h。在最佳实验条件下提取率为0.13%。通过测定大豆异黄酮对邻苯三酚的自氧化的抑制作用，抑制率为20%，得出大豆异黄酮具有较强的抗氧化功能。实验证明，将大豆异黄酮应用到面膜中，对皮肤有着明显的改善，可以使女性皮肤光润、细腻、柔滑、充满弹性、焕发靓丽光彩。关键词：豆渣；大豆异黄酮；抗氧化性；面膜 AbstractBean dregs is the by- product of bean products. It can be used as forage and fertilizer. The paper mainly introduces sever always in using the by-product. And the soybean isoflavone of soybean dregs is a very important content. . Processing conditions have large effects on isoflaviones glucosidic forms. Through some animal test, Clinical studies and epidmiological investigation showed that soybean isflavones may help prevent and even can cure cancer, atherosclerosis, osteoporosis and menopause symptoms. Besides that, soybean isoflavone has a special effect on the skin tissue because its anti-oxidation function. In fact, Using soybean isoflavone on the partial skin is more helpful than eating it. So make soybean isoflavone into cosmetics is a good choice.In this experiment, the key point is focusing on the extraction process of making soybean isoflavone into facial mask. And in this paper, soybean dregs the extraction process of soybean isoflavone done a preliminary study, in the extraction time, temperature, liquid test than on the basis of the test identified by soybean dregs soybean isoflavone extract the best technology conditions. That is expected to water ratio of 1:20, extraction at 50 under one hour. Under the optimum conditions for the extraction rate is 0.13%. At last, determination of soybean isoflavone of soybean dregs through pyrogallol self-oxidation inhibition, inhibition rate is 20%, obtained with soybean isoflavone anti-oxidation function.Key words: bean dreg; Soybean isoflavones; anti-oxidation; facial mask目 录摘要1Abstract2目 录3前言6第一章 文献综述71.1大豆异黄酮的功能71.1.1对骨质疏松的作用71.1.2大豆异黄酮对癌症的预防及认知的影响71.1.3大豆对不同人群的激素效应71.1.4大豆对心血管病疾病的预防81.1.5大豆蛋白对患有糖尿病肾病变病人肾功能影响81.2大豆异黄酮的应用81.3大豆异黄酮的研究现状91.3.1国内研究现状91.3.2国外研究现状101.4 大豆异黄酮的提取和分离精制111.5豆渣对疾病的预防及应用111.5.1对预防糖尿病的功效111.5.2对预防心血管疾病的功效111.5.4对预防肥胖症的功效121.5.5有氨基酸互补的功效121.6应用121.6.1豆渣的粗利用121.6.2豆渣酱油121.6.3可食用纸121.6.4豆渣中可溶性膳食纤维的研究121.7本文主要研究内容13第二章 实验部分142.1实验材料142.2主要仪器与试剂142.2.1主要仪器142.2.2主要试剂142.3 豆渣化学成分分析142.3.1 含水量的测定142.3.2蛋白质含量测定142.3.3脂肪含量的测定162.3.4 膳食纤维的测定172.3.5灰分的测定182.4大豆异黄酮的提取182.5大豆异黄酮提取单因素实验192.5.1料液比选择实验192.5.2乙醇浓度选择实验202.5.3浸提时间选择实验202.5.4浸提温度的选择实验202.6大豆异黄酮的正交试验202.7邻苯三酚-抗氧化功能的测定202.8大豆异黄酮在面膜中的应用212.8.1面膜的调制212.8.2试用调查21第三章 结果与讨论223.1豆渣成分分析结果223.2 大豆异黄酮提取工艺单因素实验223.2.1 料液比对大豆异黄酮提取率的影响223.2.2乙醇浓度对大豆异黄酮提取率的影响233.2. 3浸提温度对大豆异黄酮提取的影响233.2.4 浸提时间对大豆异黄酮提取的影响：243.3大豆异黄酮提取工艺正交实验253.3.1大豆异黄酮样品正交实验的结果及分析263.3.2 正交试验的极差和方差分析273.3.3以最优的工艺参数提取大豆异黄酮283.4面膜使用后的感官评定28第四章 结论和展望304.1 结论304.2 展望30致 谢31参考文献32前言我国是大豆的故乡，有着悠久的种植历史。大豆是主要的油料作物和重要的食物资源之一。大豆独特的全面而丰富的营养成分，使得大豆加工业方兴未艾。大豆蛋白、大豆活性成分、大豆皮等得到了深人的研究和应用。作为豆制品加工过程中的副产品的豆渣以其富含膳食纤维及钙、磷、铁、维生素等营养成分深得科学工作者和商业界的青睐。近期，对豆渣的研究主要集中在一般性应用如油炸食品、烘烤食品等的辅料和豆渣膳食纤维的研究。日本、美国等已经出现以豆渣为原料膳食纤维产品，国内也有多家公司如河南神龙纤维有限公司实现了豆渣制品的产业化。采用现代科技手段对豆渣进行深人的研究与加工，使得营养成分得以全面开发，解决废弃豆渣所造成的环境污染。开发利用豆渣具有广阔的市场潜力和良好的前景。异黄酮是黄酮类化合物中的一种，主要存在于豆科植物中，大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。由于是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此大豆异黄酮又称植物雌激素，能够弥补30岁以后女性雌性激素分泌不足的缺陷，改善皮肤水分及弹性状况，缓解更年期综合症和改善骨质疏松，使女性再现青春魅力。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。大豆异黄酮是从非转基因大豆精制而成的生物活性物质，是一种具有多种重要生理活性的天然营养因子，是纯天然的植物雌激素，容易被人体吸收，能迅速补充营养。 第一章 文献综述1.1大豆异黄酮的功能1.1.1对骨质疏松的作用大豆异黄酮对骨质疏松的作用大豆等制品可缓解妇女更年期后的骨质疏松，但机制还不十分清楚。非类固醇的植物雌激素在骨重建上与传统雌激素不同。骨上有ER，可与雌激素特异结合1。Gen减低去卵巢鼠小梁骨和密质骨的丢失，这一点与雌激素作用机制不同。它还可降低禽破骨细胞活性，减少去卵巢鼠的骨丢失，这一现象在合成异黄酮-依普黄酮对骨细胞培养的影响中也可观察到。Gen增加骨形成指标-碱性磷酸酶活性，而此作用可被雌激素拮抗物降低，建议Gen的此作用类似雌激素。而Dai降低骨转换率则可能是通过生长因子、细胞因子的作用所致。当生长因子、细胞因子在破骨细胞活性中发挥作用时，也可能通过Gen诱导凋亡或通过Gen影响多种酪氨酸激酶介导的通路所致2。1.1.2大豆异黄酮对癌症的预防及认知的影响因为大豆异黄酮的雌激素效应，对大豆是否刺激雌激素依赖的肿瘤生长普遍比较关注。乳癌发生的风险与高雌激素血浓及其代谢产物有关，也与短的月经周期，从而延长雌激素暴露时间有关。大豆异黄酮浓度与血、尿雌二醇浓度呈负相关，乳癌发生的风险相应低1/9。乳腺组织密度与乳癌发生呈正相关3。对无胸腺的去卵巢鼠皮下移植MCF-7乳腺癌细胞，该细胞是雌激素依赖细胞，Gen和大豆蛋白可刺激其生长。但该试验存在方法学上的问题，它选用的是无胸腺鼠。改用有胸腺的去卵巢鼠皮下移植MCF-7乳腺癌细胞，注射或饲喂Gen，则结果与上述相反. 34位停经前妇女服用100mg/d大豆异黄酮1年对乳腺组织密度无影响。67位停经前与停经后妇女服用40mg/d，小于56岁组乳腺组织密度无改变。5665岁组乳腺组织密度显著降低。平均25岁的27个年轻妇女，服用含100mg/d的大豆异黄酮的高蛋白饮食，短期与长期记忆及脑灵活性均有改善4。53位绝经后妇女服用大豆异黄酮110mg/d6月，与对照组比，词语记忆明显改善。1.1.3大豆对不同人群的激素效应大豆异黄酮浓度与血清雌二醇、睾酮浓度呈负相关5；与血浆SHBG呈正相关。体外研究显示Gen、Dai与equol能刺激SHBG合成。Dai降低睾酮氧化，睾酮氧化与卵巢类固醇激素生物合成有关，植物雌激素降低许多重要的类固醇激素生物合成代谢酶，这也是植物雌激素预防疾病作用机制之一6。黄体期雌二醇显著降低仅见于亚洲妇女。大豆异黄酮显示雌激素活性或抗雌激素活性主要取决于受试对象本身的激素代谢状态7。对高激素水平者如年轻动物或雌激素化的动物及年轻妇女，显示抗雌激素活性。对低雌激素水平者，如幼小动物去卵巢动物和自然绝经或手术绝经妇女显示雌激素活性8。1.1.4大豆对心血管病疾病的预防 大豆营养很丰富，其中大豆异黄酮对人身体很有益处，它可以说是一种强乳化剂，能够阻止胆固醇在人体血管内壁的沉垢物，除了阻止沉垢形成之外还可以清除少量的沉积物，使这些沉积物处于悬浮状态，能促使人体血管等组织将脂类吸收，同时还能降低血液的粘度，促进血液循环，对心血管患者有极大好处，能预防心脑血管疾病，且没有副作用。大豆异黄酮促进血液循环，当血液循环系统送至大脑时，能促进大脑活动，这就可以增强大脑的记忆力，起到健脑益智、延年益寿、延缓衰老的效果。27个中年健康男人服用含60mg/d 大豆异黄酮的大豆蛋白可减少5min演讲应激反应及冷压力反应的舒张期血压9。 大豆异黄酮还可增强老年鼠的血管反应。尽管大豆异黄酮可能具有其它的抗动脉粥样硬化的效应， 但大豆异黄酮不能单独影响血脂水平。1.1.5大豆蛋白对患有糖尿病肾病变病人肾功能影响大豆异黄酮具有利尿的作用，又能溶解体内的沉积物，因此可以促使细胞内的废物和尿一起排除体外，达到保护肾脏的目的。两个研究均表明大豆蛋白对肾功能特别是糖尿病肾病变病人肾功能有好的影响。近年来，随着生物科技的发展，分析手段的进步，对大豆种生物活性物质研究日益深入，已开发出大豆包括大豆异黄酮在内的保健食品、药品、食品添加剂、化妆品等商品10。大豆及其制品被视为朝阳产业，大豆异黄酮也被誉为21世纪的维生素，这无疑给我们带来了巨大的商机11。1.2大豆异黄酮的应用 大豆异黄酮是大豆生长过程中的一种次级代谢产物，是大豆中主要的生理活性物质， 具有很高的药用价值。近年来由于大豆异黄酮的生理功能受到广泛的关注,大豆异黄酮具有抗癌、防癌、预防骨质疏松等一系功能，因此开发利用大豆异黄酮作为保健食品或美容用品基料和添加剂具有重要意义。近年来对大豆异黄酮的研究日趋完善，产品也在不断涌现但进入产品化不多，如华北制药，广州邦利生物科技有限公司，天菊集团，上海天能生物保健品有限公司等企业已有生产。还有中国医学科学院药物所研究制的金转停胶囊是以天然异黄酮提取物为原料的产品。随着在保健品工业中的广阔开发应用目前国际学术界对妇女和婴幼儿的可能不良影响正引起重视。对大豆异黄酮潜在的毒性研究主要集中在其致癌对生殖系统的影响免疫毒性等方面。国外早有许多相关报道。日本一家公司开发出水溶性高，大豆异黄酮苦涩味很少的制品，称之为“富士黄酮”12。可应用于饮料、甜点心一类的健康食品。日本丰年公司开发了“丰年大豆异黄酮”制品，纯度高达80%以上。日本开发出的富含异黄酮的“大豆胚芽茶”功能饮料，被列入日本“特定保健用食品”名单。美国有数十家公司生产上百种大豆蛋白粉，大豆卵磷脂和大豆异黄酮类的保健食品。澳大利亚开发出一种供中年妇女食用的大豆营养补充剂，每日使用5克 ,其中含有大豆异黄酮80mg，大豆蛋白4000mg，野生山药250mg13。中国天能公司研制大豆异黄酮复配置品年宝片保健食品，由大豆异黄酮、碳酸钙、维生素D为主要原料制成。经功能实验证明，具有增加骨密度的保健功能。经临床应用，还缓解妇女更年期症状的作用14。中国医学科学院药物所研制的金转停胶囊，是以天然异黄酮提取物为原料，经功能实验证实，该产品能够抑制肿瘤的生长转移15。1.3大豆异黄酮的研究现状 早在1940年，研究者就注意到澳大利亚某些牧场中的绵羊生殖能力很强，通过研究发现这是因为牧场中含有一种特殊的三叶草植物，其富含的芒柄花素可在绵羊的胃中酵解为一种大豆异黄酮黄豆苷元16。从那个时候起，研究者就开始逐渐去关注异黄酮对于健康的作用，最后掀起了研究异黄酮的热潮17。直到1986年，美国科学家首次发现大豆中含有抑制癌细胞的异黄酮。1990年6月，美国国家癌症研究院组织研讨了大豆的抗癌效果，肯定大豆异黄酮是最佳的天然物质。此后又证实大豆异黄酮可以防止骨质疏松症，减轻妇女更年期不适症以及降低冠心病的发病率。美国是癌病多发病国家之一，美国每年因为癌症造成的医疗费用等开支高达1100亿美元，并呈上升趋势18。美国FDA还正式批准大豆为健康食品，并取消在1983年规定的学生午餐、副食中大豆蛋白只能占蛋白质摄入量的30%的规定。异黄酮研究的突破，令大豆身价培增。在美国、日本等世界发达国家，以大豆异黄酮为主要成分的保健食品已经成为了一种新型畅销食品19。据统计，去年全球各种大豆异黄酮保健食品总销售额已达到23亿美元含有大豆异黄酮的保健食品达数十种之多。目前，该类产品最大的生产商是美国的ADM公司。1.3.1国内研究现状中国是大豆的故乡，已经有3000年的种植史，其产量居美国、巴西之后，位居世界第三位。遗憾的是我国对大豆的利用还仅限于“榨油”，至今市售的大众化大豆异黄酮保健食品品种较少。通过研究证实国产大豆的异黄酮的含量高于国外的转基因大豆，因此，大豆异黄酮的开发也将成为国产大豆摆脱大豆和豆油进口压力之苦的契机。我国政府对发展大豆产业也极为重视，实施了“国家大豆行动计划”20。2003年年初，国家四部委联合下发了关于进一步扶持我国大豆产业发展有关措施的通知，其中，明确提出要以开发大豆磷脂、皂苷、异黄酮食用纤维等功能性食品为方向，加快研究高质量、高附加值、高效益的具有特殊营养功能的大豆新产品21。所以，国内食品科研部门应尽快立项开发此类产品，这样不仅能填补国内市场的空白，还能提高大豆产品的附加值。1.3.2国外研究现状对大豆异黄酮的报道始于1931年,Walz用90%甲醇从豆奶中首先提取出5,7,4-三羟基异黄酮-7-葡萄糖苷,并发现它能被盐酸水解成一分子的燃料中黄铜和一分子的葡萄糖。1995年世界卫生组织以夏威夷希洛市70岁以上的日本女性移民和冲绳县50年代和70年代女性，日本关西50年代女性为研究对象，主要测试了大豆异黄酮的摄取量与骨密度相关性的调查发现；踵骨骨密度与大豆异黄酮的摄取量相关。1996年美国国家癌症研究中心将大豆异黄酮的主要成分染料本素 列为肿瘤化学预防药物发展计划之一。1998年美国Potter教授等报到了大豆异黄酮的人体服用实验，对高胆固醇血症的闭经后女性实验证明连续服用大豆异黄酮6个月，每日56-90mg，使血中的低密度脂蛋白脂固醇含量明显下降，而高密度脂蛋白胆固醇含量明显上升，表明大豆异黄酮具有抑制动脉粥样硬化作用。因此美国、日本、法国、德国、澳大利亚等国纷纷投入大量资金、人力、物力进行基础研究和开发应用研究。在国际上，大豆异黄酮做为健康食品的热门课题已被世界列入十大最佳投资项目之一。美国、欧洲及日本、韩国等国家和地区，以大豆异黄酮为主要成分的保健食品成为了一种新型畅销食品，市场上含有大豆异黄酮的保健食品的各种制剂，如片剂、口服液、粉剂等达数十种之多，高纯度的大豆异黄酮已应用于医药产品的开发22。美国食品与药品管理局(FDA)早在1996年就已批准大豆异黄酮作为健康食品上市。随着人们对其功能性和营养性研究的深入，它在食品、医药、保健品及其它行业中的应用将越来越广泛，市场潜力极大。目前国际市场对大豆异黄酮的年需求量在1500吨，而实际的年产量仅为500吨左右23。据统计，2000年全球各种大豆异黄酮保健食品总销售额已达23亿美元，可以看出大豆异黄酮类产品已经成为了保健食品中的一匹“黑马”。我国大豆异黄酮食品和保健食品的投资热潮从前年开始，北京化工大学裕华生物制药工程联合实验室在国内最早开发出了大豆异黄酮批量生产技术，其终端产品也是国内第一个取得卫生部批准文号的以大豆异黄酮为主要原料的保健食品。我国成规模的大豆异黄酮生产企业约10余家，总产能力约7080吨，实际产量仅为50吨。国内对异黄酮的需求量仍然很低，只有几个保健食品企业和一些研究机构的零星采购，且出口的大豆异黄酮多是含量在40%的原料24。奘灵大豆异黄酮高纯度活化型大豆异黄酮，被人体吸收利用率近99%。今后国内外学者的研究方向将会更加关注大豆异黄酮对人体和动物多方面的药性作用，特别是加强对药性作用引起的生理和代谢变化的研究。随着分子生物学和遗传学的发展将进一步从分子水平上探讨大豆异黄酮的药性作用机理，不仅能为开发和研制新型药品和保健品并尽快用于临床治疗奠定基础，也将成为未来大豆异黄酮研究的新趋势。1.4 大豆异黄酮的提取和分离精制 随着大豆异黄酮的功效逐步为人们所认识，大豆异黄酮制品的开发生产也受到研究者的广泛关注。由于大豆的组分复杂，而其中大豆异黄酮的含量较低，通过溶剂法等方法所得到的提取液中存在大量的蛋白质、可溶性碳水化合物，即使采用脱脂大豆粕作为原料，仍含有一定的油脂25。为了获得大豆异黄酮含量较高的大豆提取物，研究合适的分离精制工艺，分离去除杂质（包括脂肪、蛋白、糖、盐等）显得尤为必要。 目前，异黄酮等有效物质的精制方法主要有：有机溶剂萃取法、柱层析法、超滤法、超临界CO2萃取法等方法26。但利用有机溶剂萃取法提取大豆异黄酮是目前最常用的方法，考虑操作难易程度，操作成本以及溶液毒性等因素，最常用的有机溶剂是乙醇水溶液。1.5豆渣对疾病的预防及应用我国是世界上种植大豆的主要国家，大豆的产量很高，现在全国普遍种植，豆制品的加工也方兴未艾。然而在豆制品加工过程中作为副产品的豆渣却没有得到有效的利用，仅作为饲料或作为废弃物处理，其经济效益是很低的，同时也造成了大量环境污染。大豆豆渣是加工大豆制品的副产物，具有丰富的营养价值和独特的保健功能。含富含有膳食纤维，蛋白质，水分，脂肪，灰分等主要成分。还含有钙、磷、铁、维生素等营养成分以及大豆异黄酮等微量珍贵成分27。1.5.1对预防糖尿病的功效 高纤维膳食对治疗胰岛素依赖型糖尿病患者是有效的。可溶性纤维可降低餐后血糖生成和血浆胰岛素升高的反应，其原因是因为高纤维的膳食可以改善末梢组织对胰岛素的感受性，降低对胰岛素的需求,从而达到调节糖尿病患者的水平，其次由于膳食纤维在肠内可形成网状结构，增加肠液的薪度，使食物与消化液不能充分接触，阻碍葡萄糖的扩散使葡萄糖吸收减慢，从而降低血糖含量，改善葡萄糖耐量和减少血糖药物的用量，起到防止糖尿病的作用28。1.5.2对预防心血管疾病的功效 大豆膳食纤维分子表面带有很多活性基团,可以吸附鳌和胆固醇、胆汁酸及肠道内的有毒物质内源性毒素、化学药品和有毒医药品外源性毒素等有机化合物。膳食纤维的这种吸附鳌和的作用,促进了体内血脂和脂蛋白代谢的正常进行,抑制或延缓胆固醇与甘油三醋在淋巴中的吸收,增加胆固醇的排出量,降低血清胆固醇浓度,从而预防高血压、高血脂、心脏病和动脉硬化,减少冠心病和心脑血管疾病的发病率。1.5.3对预防肠癌利便的功效膳食纤维的高持水力,改善了大肠的功能,抑制腐生菌的生长,减少次生胆汁酸的生成等。也加强了大肠的蠕动，增加粪便的含水量及体积,缩短排空时间,降低结肠压力,促进粪便的排泄同时使肠道内致癌物及一些有毒物质随粪便排出,减少致癌物与结肠 的接触机会,从而达到预防肠癌的功效29。1.5.4对预防肥胖症的功效 膳食纤维体积较大,水膨胀后体积更大,在胃肠道内会发挥填充剂的容积作用,易引起饱腹感11。同时,由于膳食纤维还会影响可利用碳水化合物等成分在肠道内的消化吸收,也不易产生饥饿感 。因此对预防肥胖症有独特的功效。1.5.5有氨基酸互补的功效 豆渣蛋白质的氨基酸组成与大豆蛋白基本一致,由表可知豆渣蛋白中赖氨酸含量较多,可以弥补谷类食品中赖氨酸的不足,起到氨基酸互补作用,提高蛋白质的营养价值30。1.6应用 豆渣是大豆加工过程中的副产物之一,由于其所含热能低,且口感粗糙,没有引起人们的充分重视31。过去大都作为家畜的饲料,有的索性作为废弃垃圾,造成了资源的浪费和大量的环境污染。1.6.1豆渣的粗利用 上世纪最后几十年,人们开始认识到纤维的重要作用。专家组在日内瓦会议上将膳食纤维推荐人 “人群膳食营养素指标”,确认了纤维素是人体不可少的第七营养素。豆渣含丰富的食用纤维,是膳食纤维的理想来源。豆渣利用方式较多,产品也丰富多样,其共同点是作为原料的豆渣仅是经过了简单的加工,并没有单独的利用豆渣膳食纤维32。1.6.2豆渣酱油 制作原理是将粗处理的豆渣与等量的小麦熬皮均匀混合,蒸煮后加入酱曲,发酵,再加人煎好的花椒,大料液搅匀,压滤后调制成成品酱油。1.6.3可食用纸由于环境保护的原因,开发可降解无污染的食品包装材料已经成为世界范围内的研究热点。日本酒井理化研究所已经研制成功此类产品,国内亦有企业制成豆渣可食用包装纸,它是将豆渣与酶类混合加工而成的一种无味无臭,稳定性好的纤维。1.6.4豆渣中可溶性膳食纤维的研究 可溶性膳食纤维是膳食纤维的一种,主要是指植物细胞壁内的储存物质和分泌物,另外还包括部分微生物多糖和合成类多糖,如果胶、瓜儿胶、葡聚糖和真菌多糖等 。可溶性膳食纤维具有多种生理功能,其中一些是通过对某些物质的束缚作用来实现的。一般认为,可溶性膳食纤维比不溶性膳食纤维具有更强的功能性,如持水率高,束缚肠道中某些致癌物,清除自由基,防治结肠癌,便秘等,同时水溶性膳食纤维对降低胆固醇和预防心血管疾病有着特别明显的效果。 1.7本文主要研究内容 本文对大豆异黄酮的提取工艺做了初步的研究，在对乙醇浓度、浸提时间、温度、以及料液比进行单因素试验的基础上，再通过正交试验确定了大豆异黄酮提取的最佳工艺条件。通过测定大豆异黄酮对邻苯三酚的自氧化的抑制作用，分析大豆异黄酮的抗氧化功能。最后，将提取的大豆异黄酮应用到面膜中，以检验其对皮肤的保养和抗氧化功能。- 34 -第二章 实验部分2.1实验材料豆渣（自制）；鸡蛋和蜂蜜从超市购买。2.2主要仪器与试剂2.2.1主要仪器MA110天平 上海精密科学仪器有限公司DK-8A恒温水浴箱 上海医用恒温设备厂723型可见分光光度计 上海第三分析仪器厂DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司2.2.2主要试剂无水乙醇 分析纯 苯酚 分析纯石油醚 分析纯邻苯三酚 分析纯盐酸溶液 分析纯氢氧化钠溶液 分析纯Tris 分析纯2.3 豆渣化学成分分析2.3.1 含水量的测定测定采用国标GB 549785方法33。称取样品3g(精确至0.0001g),放置于已烘干铝盒中,105烘3h后取出铝盒,加盖,置于干燥器内冷却至室温,取出称重后,再按以上方法进行复烘,每隔30 min 取出冷却称重1次,烘至前后2次重量差不超过0.005g为止。按公式(1)计算含水量。w水分=(m1-m2)/(m1-m) (1)式中:w:水分质量分数(%),m:铝盒质量(g),m1:烘前试样和铝盒质量(g),m2:烘后试样和铝盒质量(g)。2.3.2蛋白质含量测定凯氏定氮法（GB/T5009.5-2003）： 样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使得蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后于硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。以甘氨酸为例，凯氏定氮过程的化学反应如下： 消化: NH2-CH2-COOH + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 2NH3 + H2SO4(NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH2H2O + Na2SO4 + 2NH3 吸收: NH3 + 4H3BO3 NH4HB4O7 + 5H2O滴定: NH4HB4O7 + HCl + 5H2ONH4Cl + 4H3BO3在消化过程中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾、硫酸铜等物质。假如硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高发应温度，但其加入量不能太大，否则消化体系温度过高，有引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。硫酸铜除起催化作用外，还可以作消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的试剂。凯氏定氮法的实验步骤如下：（1）样品处理：准确称取固体样品0.22g或半固体样品25g，或取液体样品1020mL，小心移入干燥洁净的500mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g硫酸钾10g和浓硫酸20mL，轻轻摇匀后，按图a安装消化装置，于凯氏烧瓶口放一小漏斗，并将其以450斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部碳化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色且澄清透明后，再继续加热30min。冷却，小心加入200mL蒸馏水，待完全冷却后，加加入数粒玻璃珠以防止蒸馏时暴沸。（2）碱化蒸馏：将凯氏烧瓶按图b蒸馏装置方式连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下，吸收瓶内预先装入了50mL4%的硼酸溶液及混合指示剂23滴。放松小漏斗处的夹子，通过漏斗徐徐加入7080mL40%的氢氧化钠溶液，当漏斗中尚有少量氢氧化钠溶液时，夹紧夹子，在漏斗中作水封，加紧夹子。加热蒸馏，至安全部蒸出（馏液约250mL），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试纸检查，如无红棕色物质生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。（3）滴定：将上述吸收液用0.1mol/L盐酸标准液滴定至由蓝色变为为红色即为终点，记录盐酸溶液用量。同时做一空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白试验消耗标准盐酸溶液的体积。（4）结果计算： 蛋白质含量= 式中：C为盐酸标准溶液的浓度，mol/L； V1为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准液体积，mL； V0为滴定空白吸收液时消耗盐酸标准液体积，mL； m为样品质量，g； M氮为氮的摩尔质量，14g/mol； F为氮换算为蛋白质的系数（蛋白质中的氮含量一般为14%17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质含量）。2.3.3脂肪含量的测定索氏提取法的实验步骤：（1）滤纸筒的准备：取20cm8cm的滤纸一张，卷在光滑的圆形木棒上，木棒直径比索氏提取器的直径小11.5mm，将一端约为3cm纸边折入，用手捏紧，形成袋底。取出圆木棒，在纸筒底部衬一块脱脂棉，用木棒压紧，纸筒外面用脱脂棉线捆好，在100105烘干至恒重。（2）样品处理：A、固体样品：精确称取于100105烘干并研细的样品2.005.00g（可以取测定水分后的试样），必要时拌以海砂，装入滤纸筒内。B、液体或半固体样品：精确称取5.0010.00g样品于蒸发皿中，加入海砂约20g，于沸水浴蒸干后，在于（1005）烘干，研细，全部移入滤纸筒内，蒸发皿及附有样品的玻璃棒用蘸有乙醚或石油醚的脱脂棉擦净，将脱脂棉一同放入滤纸筒内。（3）抽提：将滤纸筒放入索氏抽提器内，滤纸筒的高度不能超过抽提筒缸吸管的高度，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，倒入乙醚或石油醚，其量为接收瓶的2/3容积，将将冷凝器与抽提筒连接好，用少许脱脂棉塞在冷凝器上口，打开连接冷凝器进水管的水龙头，于水浴上加热，进行回流抽提，控制每分钟滴下乙醚或石油醚80滴左右（夏天约65，冬天约80）。根据样品含油量的高低，一般需回流提取612好，直至抽提完全为止。（4）称量：抽净脂肪后，用长柄镊子取出滤纸筒，用抽提器回收乙醚或石油醚，待接收瓶内的乙醚或石油醚剩下12mL时，取下接收瓶，于水浴上蒸干，然后置入（1005）的烘箱，先烘至恒重（前后两次质量差在2mg以内，即为恒重）。（5）结果计算：粗脂肪含量=（g/100g）式中：m2为接收瓶和脂肪的质量，g； m1为接收瓶的质量，g； m为式样的质量，g2.3.4 膳食纤维的测定样品处理从大量的原料中提取典型的样品，在105 度的烘箱(或者70度的真空烘箱中)中干燥一个晚上，在干燥箱中冷却。干燥状态下研磨到0.30.5毫米大小。如果样品不能够加热，冷冻干燥。如果样品脂肪含量超过10%，则需要在石油醚中降脂3次，25毫克/升的样品。注意脂肪的含量要校正最后的结果。膳食纤维的测定空白实验应该在整个实验过程中进行，最后要从结果中扣除以去掉试剂等因素对结果的影响。将1克样品,称重精度到0.1毫克，在400毫升的烧杯中,混合到50毫升PH为6的磷酸缓冲溶液中，加磁力搅拌子，加100微升的热稳定的a-淀粉酶溶液，彻底混合，盖上铝箔。放到100 度的水浴中，让样品温度保持在95100度保持15分钟，控制好温度，然后从水浴中移出，冷却到室温。用10毫升的0.275N的氢氧化钠溶液调节PH 到7.5，向GDE中添加冷水将温度降到60度，加100 微升的蛋白酶溶液(50毫克放在1毫升磷酸盐缓冲液中)。烧杯盖上滤箔连续搅拌的情况下在60度时培养30分钟。冷却到室温,用0.325N的盐酸调节PH到4.04.6,用PH计控制PH值。添加300毫升的淀粉葡(萄)糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)溶液，盖上铝箔在连续搅拌的情况下60度水浴培养30分钟。拿掉搅拌子，280毫升的95%的乙醇预热60度，在室温下沉降60分钟。完全干净的玻璃坩埚，放在525度的马弗炉烘干1小时，冷却到室温，用水清洗，在空气中晾干。添加0.5 克的硅藻土，玻璃坩埚在130度的烘箱中恒重一个小时，精度0.1毫克。同硅藻土一起称重并放在CSF6 (FIWE6)的过滤器中，利用真空。用漏斗转移酶消解完的沉淀物，滤出液用导管进行收集。用20 毫升的78%的乙醇溶液洗涤沉淀物3次，10毫升的95%的乙醇溶液洗涤2次，10毫升的丙酮溶液洗涤2次。如果胶状的滤膜使的过滤能力下降，保持液体状态，用细微的空气来吹表面(仪器上操作)，整个清洗过程需要半个小时。在105的烘箱中(70的真空箱中)将玻璃坩埚连同沉淀物和硅藻土一起烘干一个晚上，冷却到室温,称重精度为0.1毫克。沉淀物的重量是最终的重量减掉坩埚的重量和硅藻土的重量(需要的重复样)。其中一个沉淀物的样用凯氏方法分析不能消化的蛋白含量(N*6.25),第二个沉淀物的样在525 度的马弗炉中烘干5个小时，在干燥箱中冷却称重(精度0.1毫克)，灰份的重量是前步的总重量减掉坩埚和硅藻土的重量后剩下的重量。计算%空白中的蛋白百分含量(SB)=空白中的蛋白含量/空白的残留量*100%空白中灰分含量(CB)=空白中的灰分量/空白的残留量*100空白量=空白中的残留物*1-(PB+CB)/100%样品的蛋白含量(SP)=样品中的蛋白量/样品残留物量*100