基于UPLC-Q-TOF-MS技术的脉络宁注射液酯提废渣大孔树脂富集液的化学成分鉴定和含量测定.pdf
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1、2638Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期基于 UPLC-Q-TOF-MS 技术的脉络宁注射液酯提废渣 大孔树脂富集液的化学成分鉴定和含量测定鲁正熹1,姚静远2,印敏2,李林蔚2,何晓东3,刘群4,李剑3,陈雨2*(1.江苏卫生健康职业学院,南京210029;2.江苏省中国科学院植物研究所/江苏省中药材生态种植与高值化利用工程研究中心,南京210014;3.南京金陵药业股份有限公司,南京210009;4.河南金陵金银花药业有限公司,河南新乡453300)摘要:目的利用超高
2、效液相-四极杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术分析脉络宁注射液酯提废渣的化学成分,为酯提废渣资源的再利用提供科学依据。方法利用 ASD-7大孔树脂柱富集脉络宁注射液酯提废渣化学成分,采用 UPLC-Q-TOF-MS 技术对脉络宁注射液酯提废渣大孔树脂富集液进行数据采集和化学成分鉴定,采用定量软件对绿原酸、异绿原酸、异绿原酸 C、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙进行含量测定。结果共鉴定出脉络宁注射液酯提废渣中 42 个化学成分,包括 9 个酚酸类化合物、9 个黄酮类化合物、10 个环烯醚萜类化合物、8 个三萜皂苷类化合物、5 个苯丙素类化合物和 1 个联苄类化合物,定量分析结
3、果显示绿原酸、异绿原酸、异绿原酸 C、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙在考察的浓度范围内与峰面积线性关系良好(r 0.9990),精密度、重复性和稳定性良好,加样回收率为 95.38%103.06%,RSD 为 0.76%1.8%。结论本研究可用于脉络宁注射液酯提废渣大孔树脂富集液中化学成分的鉴定以及 5 种有效成分的准确定量分析,为脉络宁注射液酯提废渣的再利用和制备工艺奠定基础。关键词:脉络宁注射液酯提废渣;超高效液相-四极杆串联飞行时间质谱;化学成分鉴定;含量测定中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号:1672-2981(2023)10-2638-09doi:10.7539/j.
4、issn.1672-2981.2023.10.014Chemical composition and content determination in macroporous resin enrichment solution from ester extraction residue of Mailuoning injection based on UPLC-Q-TOF-MSLU Zheng-xi1,YAO Jing-yuan2,YIN Min2,LI Lin-wei2,HE Xiao-dong3,LIU Qun4,LI Jian3,CHEN Yu2*(1.Jiangsu Health Vo
5、cational College,Nanjing 210029;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Eco-cultivation and High-value Utilization of Chinese Medicinal Materials,Institute of Botany,Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210014;3.Jinling Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanjing 210009;4.Henan Jin
6、ling Honeysuckle Pharmaceutical Co.,Ltd.,Xinxiang Henan 453300)Abstract:Objective To identify chemical components and determine the content in macroporous resin enrichment solution from ester extraction residue of Mailuoning injection by ultraperformance liquid chromatography quadrupole time-of-flig
7、ht mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS)technology,and to provide a scientific basis for the reuse of ester extraction residue of Mailuoning injection.Methods Mailuoning injection ester extraction residues were enriched by ASD-7 macroporous resin columns.UPLC-Q-TOF-MS technology was used to collect the d
8、ata and identify chemical components in it,and the content were determined by quantitative software.Results Totally 基金项目:江苏省高等学校自然科学研究面上项目(No.19KJB360008);江苏省林业科技创新与推广项目(No.LYKJ202118)。作者简介:鲁正熹,男,硕士,讲师,主要从事药物分析、药物化学研究,email:*通信作者:陈雨,男,研究员,博士研究生导师,主要从事天然药物化学研究,email:2639中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期
9、Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 脉络宁注射液,为黄棕色至红棕色的澄清液体,由金银花、山银花、牛膝、玄参、石斛等组成,有清热养阴、活血化瘀的功效,临床上用于治疗血栓闭塞性脉管炎1、急性缺血性脑血管病2、急性脑梗死3、静脉血栓形成4、动脉硬化性闭塞症5、脑血栓形成及后遗症6。有研究表明,脉络宁注射液在一定程度上对治疗急性缺血性卒中7、腰椎间盘突出症8、非酒精性脂肪肝9、急性肺损伤10,喉头水肿11等也有效。脉络宁注射液采用水煎煮提取药效物质,经乙醇沉淀、乙酸乙酯萃取、浓缩等精制而得12,导致在生产过程中产生了大量废渣。中药废渣的处理
10、一直是我国医药行业和环境行业所关注的问题,通常采用填埋、焚烧、固定区域堆放等措施处理,但会对周围的水质、土壤和空气造成严重的污染,影响环境质量,且耗费大量资金13,因此对中药废渣的资源再利用极其重要。到目前为止,有关脉络宁注射液废渣的资源再利用,主要是对水提和醇沉物的研究12,14-16。乙酸乙酯萃取后的母液废渣,为生产脉络宁注射液过程中的废弃物之一,如不进行资源化再次利用,不仅造成浪费,而且作为废渣排放还会造成二次污染。本研究运用超高效液相-四极杆串联飞行时间质谱 技 术(ultraperformance liquid chromatography quadrupole time-of-fl
11、ight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)对脉络宁注射液酯提废渣化学成分进行鉴定,并对其中的酚酸类成分(绿原酸、异绿原酸 A和异绿原酸 C)和三萜皂苷类成分(灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙)进行定量分析,以期为脉络宁注射液酯提废渣资源再利用提供科学参考,从而为后续中药渣的回收利用和环境保护奠定基础。1材料1.1仪器 Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-Q-TOF-MS液质联用仪(美国 Agilent公司);KQ-400KDE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);JY/YP型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司);SPING-S
12、5i超纯水仪(南京妙之仪电子科技有限公司);OSB-2200 型旋转蒸发仪(日本 EYELA公 司);Q-TOF Quantitative Analysis定 量 软 件;Molecular Structure Correlator结构鉴定软件。1.2试药 甲醇(色谱纯,美国 TEDIA 公司);无水乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲酸(色谱纯,美国 ROE SCIENTIFIC INC 公司);蒸馏水(屈臣氏);ASD-7 大孔吸附树脂(郑州和成新材料科技有限公司);硅胶(青岛海洋化工厂);绿原酸(批号:0753-9607)、异绿原酸 A(批号:111782-201807)、异 绿
13、 原 酸 C(批 号:111894-202104)(中国食品药品检定研究院);灰毡毛忍冬皂苷甲、灰毡毛忍冬皂苷乙来自本课题组分离,所有对照品纯度均大于 95%。本研究所用脉络宁注射液酯提废渣来自金陵药业股份有限公司,共 8 个批次,分别为20210228、20210301、20210302、20210303、20210312、201210313、20210314、20210315。2方法与结果2.1溶液的制备2.1.1供试品溶液的制备称取一定质量的脉络宁注射液酯提废渣,废渣-水为 110 稀释,稀释液经 ASD-7 大孔树脂柱梯度洗脱,洗脱剂为 0%、42 chemical component
14、s were identified,including 9 phenolic acids,9 flavonoids,10 iridoids,8 triterpenoid saponins,5 phenylpropanoids,and 1 dibenzyl.UPLC-Q-TOF-MS was used to quantitatively analyze the contents of chlorogenic acid,isochlorogenic acid A,isochlorogenic acid C,macranthoidin A and macranthoidin B.The linear
15、ity was good(r 0.9990),the precision,repeatability and stability were good,the recovery ranged 95.38%103.06%,and the RSD was 0.76%1.8%.Conclusion The method for the chemical components can identify the chemical components and accurately quantify the 5 effective components in macroporous resin enrich
16、ment solution from Mailuoning injection ester extraction residues,laying a foundation for the reuse and preparation of Mailuoning injection ester extraction residues.Key words:Mailuoning injection ester extraction residue;ultraperformance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrom
17、etry;chemical component identification;content determination2640Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期10%、90%、100%乙醇水溶液,取 90%乙醇水溶液洗脱部位 500 L,氮吹至干,1 mL甲醇溶解,甲醇稀释 10 倍,过 0.45 m微孔滤膜,即得。其中 90%乙醇水溶液部位大孔树脂得率为 43.31%60.77%,8 批脉络宁注射液酯提浸膏过大孔树脂后 90%乙醇水溶液部分干燥质量分别为 11.5、1
18、2.0、12.1、12.4、18.5、17.9、22.4、28.5 mg。2.1.2对照品储备溶液的制备精密称定绿原酸、异绿原酸 A、异绿原酸 C、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙,制成 33.33、16.67、33.33、16.67、66.67 gmL 1的对照品储备溶液,冷藏备用。2.2色谱条件 色谱柱 Agilent Poroshell 120 SB-AQ C18(3.0 mm100 mm,2.7 m);柱温 0 20 min,20;2075 min,40;流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0 20 min,20%25%B;20 25 min,25%35%B;25
19、 40 min,35%50%B;40 75 min,50%70%B);流速为 0.3 mLmin 1;进样量为 5 L。2.3质谱条件 采用 ESI离子源,离子化模式为负离子模式,毛细管电压为 3.5 kV,干燥气温度 350,裂解电压为:酚酸、黄酮和环烯醚萜 90 V,三萜皂苷210 V,碰撞能量为 195 V,雾化气体为 N2,离子扫描范围为 m/z 100 1700,雾化气压力 50 psi,干燥气流速 10.0 Lmin 1,Skimmer电压 65 V。2.4UPLC-Q-TOF-MS 定量方法学考察 2.4.1专属性试验精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液适量,进样分析,各成分出峰位
20、置无干扰组分,表明本法专属性良好,符合液质定量分析要求,典型色谱图见图 1。表 15 种分析物的线性范围、回归方程、相关系数、检测限和定量限 Tab 1Linear ranges,calibration curves,coefficients,limit of quantitation and detection of 5 analytes化合物线性范围/(gmL 1)回归方程r检测限/(ngmL 1)定量限/(ngmL 1)绿原酸2.3598 33.9970Y 1.1130106X 6.60881050.9997 7.5037.50异绿原酸 A1.2632 16.6984Y 7.040310
21、5X 4.08701050.999413.0232.55异绿原酸 C2.3240 33.2974Y 7.5510105X 9.94701050.999715.0044.50灰毡毛忍冬皂苷乙4.1397 66.3830Y 9.7132104X 7.32831040.9997 2.75 6.25灰毡毛忍冬皂苷甲1.2035 16.6982Y 2.4360105X 7.32841040.9997 3.75 9.37图 1混合对照品(A)和脉络宁注射液酯提废渣(B)UPLC-Q-TOF-MS 图Fig 1UPLC-Q-TOF-MS of mixed control(A)and Mailuoning i
22、njection ester extraction residue(B)1.绿原酸(chlorogenic acid);2.异绿原酸 A(isochlorogenic acid A);3.异绿原酸 C(isochlorogenic acid C);4.灰毡毛忍冬皂苷乙(macranthoidin B);5.灰毡毛忍冬皂苷甲(macranthoidin A)2.4.2线性关系、检测限和定量限分别精密吸取对照品储备液适量于 5 mL具塞棕色量瓶中,以甲醇逐步稀释配成系列混合对照品溶液,进样测定峰面积,以峰面积(Y)对对照品质量浓度(X)进行线性回归,计算 5 种分析物的回归方程,结果见表 1。26
23、41中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 2.4.3精密度试验取供试品溶液,连续进样 6次,分别计算 5 种分析物峰面积的 RSD,结果峰面积的日内精密度 RSD 在 2.3%4.5%,表明仪器精密度良好。2.4.4稳定性试验取供试品溶液,分别于0、4、8、12、24 h进样分析,分别计算 5 种分析物峰面积的 RSD,结果峰面积的 RSD 分别在 0.60%4.6%,表明测定成分在 24 h内稳定性良好。2.4.5重复性试验取平行制备的 6 份供试品溶液(批号:202103
24、03),进样测定峰面积,计算得绿原酸、异绿原酸 A、异绿原酸 C、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬皂苷乙的质量分数分别为10.98、3.92、8.06、36.90、3.87 mgg 1,峰面积的 RSD分别为 0.80%、1.7%、1.6%、0.60%、1.0%,表明方法重复性良好。2.4.6加样回收试验取已知含量的脉络宁注射液酯提废渣处理液 9 份(批号:20210314),分别加入低、中、高 3 个浓度的混合对照品溶液,进行含量测定,计算得 5 个成分的加样回收率为95.38%103.06%,RSD 为 0.76%1.8%,表明本方法准确性良好。2.5UPLC-Q-TOF-MS 定性分析脉络宁
25、注射液酯提废渣 经过色谱条件优化,供试品溶液在负离子模式下的色谱图得到了良好的分离效果及离子化效率,其 TIC图见图 2。图 2负离子模式下的脉络宁注射液酯提废渣 TIC 图Fig 2Total ion chromatogram of Mailuoning injection ester extract ion residues at the negative ion mode样品经 UPLC-Q-TOF-MS进行一级及二级质谱采集,获得提取液中各色谱峰的保留时间、准分子离子峰及 MS/MS碎片离子的精确相对分子质量信息。若目标成分与其对照品(无对照品的与参考文献数据比对17-18)的保留时间
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