生物化学实验论文-从啤酒酵母中提取蔗糖酶.doc
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1、生物化学实验论文 从啤酒酵母中提取蔗糖酶 作者: 日期:13 个人收集整理 勿做商业用途题名:酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定姓名:宋烙学院:长三角绿色制药协同创新中心班级:绿色国际班学号:2012013914162013 年12 月 27日填酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定浙江工业大学 绿色制药协同创新中心 宋烙摘要:采用自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶,通过离心、热提取、95%乙醇沉淀提取、Q Sepharose-柱层析法来对蔗糖酶进行纯化.至于活力的测定,首先利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定5min内酶能催化生成葡萄糖的量来对得到的各个提取液进行蔗糖酶活力的测定。然后再通过Folin-酚
2、法测定蔗糖酶蛋白质含量,之后就可以计算出各个提取液的比活力.最后,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蔗糖酶的相对分子质量。关键词:蔗糖酶; 提取纯化; 酶活力; 蛋白质含量; 相对分子质量The Extraction Method of Beer Yeast Sucrose and Vitality TestZhejiang University of Technology Green Pharmacy Xietong Chuangxin CentreSong LuoAbstract: The autolysis extracts sucrose from beer yeast. Then,
3、purifying the sucrose by centrifugalization, hot extraction, 95% ethanol sediment extraction, and Q-Sepharosecolumn chromatography. As for calculate the radio of live, first of all, using 3,5dinitrosalicylic acid(DNS)to calculate the each extracting solutions radio of live by measure how much sucros
4、e the sucrose can catalysis。 After that, calculating the content of sucrose by using Lowry method., so its available to calculate each extracting solutions specific activity. Finally, we used SDSpolyacrylamide gel eletrophoresis to measure the sucroses relative molecular mass.本文为互联网收集,请勿用作商业用途个人收集整理
5、,勿做商业用途Keyword: sucrose; extraction; vitality; specific activity; relative molecular mass前言:本实验的是一个综合性的教学实验,主要是为了让学生养成规范的科学实验习惯,树立严谨的科研作风.本次综合性的实验既保留了一些旨在加强学生基本实验方法和技能训练的传统实验,也引进了一些新近发展起来的生化实验技术。旨在培养我们的动手能力和良好的科研素质,使我们有一个完整的实验锻炼过程,培养了我们科研思维和独立展开科研工作的能力。蔗糖酶(Sucrase, EC 3.2.1。26)又称转化酶(Invertase),1928年
6、Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在,蔗糖酶广泛存在于微生物、植物、动物中1。蔗糖在蔗糖酶的催化下生成葡萄糖和果糖。然而,蔗糖酶有多种同工酶,分别处于不同的亚细胞位置,生化特性也不尽相同。23蔗糖酶在啤酒酵母细胞汇总存在着两种形式。一种存在细胞膜外细胞壁中高度糖基化的胞外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分,含有50%糖的成分。该酶是啤酒酵母蔗糖酶的主要形式.而另外一种是存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的胞内蔗糖酶。1. 材料与方法 1。1材料与仪器 1。1。1 材料 啤酒酵母(市售) 1。1。2 仪器 高速冷冻离心机Thermo(SORVALL)BIOFOGESTRATOS
7、;紫外分光光度计 T6新世纪;恒温水浴槽;DYY6D型电泳仪;凯氏定氮仪等. 1。1.3 试剂 醋酸钠(AR);甲苯(AR);4mol/L 醋酸;95%乙醇;0。5mol/L TrisHCl PH7。3 缓冲液;0.05mol/L Tris-HCl PH7.3 缓冲液;浓硫酸;硫酸钾与硫酸铜混合粉末;30%NaOH溶液;2mol/l NaOH溶液;0。5mol/l NaOH溶液;2硼酸溶液;混合指示剂;0.01 mol/L HCl 标准溶液;试剂A(碱性铜试剂);试剂B(酚试剂);标准浓度牛血清蛋白溶液(200g/ml);30丙烯酰胺溶液;10%的N,N,N,N四甲基乙二胺;10%过硫酸铵溶液
8、;分离胶缓冲液;浓缩胶缓冲液;2SDS-样品缓冲液;SDS-电极缓冲液;10%SDS;染色液;脱色液;标准蛋白液;3,5-二硝基水杨酸;葡萄糖标准溶液(0。2 mg/ml);5%蔗糖(用0。2mol/l PH4。6醋酸缓冲液配置);1mol/l NaCl的0。05mol/L TrisHCl PH7.3 缓冲液;Q Sepharose等。 1。2方法 1.2。1 蔗糖酶粗品的制备 将20g鲜酵母倒入250m1锥形瓶中、加入1。6g醋酸钠,搅拌1520min,使团块的鲜酵母液化,加1。5ml甲苯用大小合适的软木塞将瓶口塞住,摇动10min使甲苯和酵母液充分混匀, 放入37恒温培养箱中保温60h,使
9、得酵母自溶.然后加入10ml 蒸馏水,摇匀,再用4、15000rmin离心10min,取中间层的液体,重新倒入离心管,再用4、15000rmin离心10min.仔细倒出上层清液,用量筒测出体积VA。取出3ml用于后续的活力测定,剩余的为初提取液A。1.2.2 蔗糖酶的初提纯 将初提取液A倒入50ml的锥形瓶中,加入4mol/L醋酸3.2ml左右,使溶液的pH值约为4。5左右,摇匀,50恒温水浴中保温30min,在保温过程中不断地摇动锥形瓶,取出后迅速在冰浴中冷却,冷却液于4、15000r/min 离心10min,仔细地倒出上层清夜,测量体积,记为VB,。此提取液为热提取液B。取出3ml用于后续
10、的活力测定,将热提取液B倒入100ml烧杯中,把烧杯放入冰浴中,轻轻搅拌并缓慢加入95%乙醇的溶液,体积与热提取液B相同。整个过程不少于35min,再继续搅拌10min。将烧杯内的液体全部移入离心管中,白色固体保留待用,4、15000r/min 离心10min。仔细地倒掉上层清液、用5ml0.05mol/L Tris-HCl pH 7.3 缓冲液把烧杯中的白色粘稠固体溶解,倒入离心管搅拌使离心管内的白色固体溶解,4、15000r/min 离心10min,上层清液为乙醇沉淀提取液C、测量其体积。1.2.3 蔗糖酶的纯化 首先用Q Sepharose凝胶填充离子交换柱,然后,在梯度发生器中的与柱相
11、连接的杯子中加入30ml 0。05mol/L TrisHCl pH7。3缓冲液,在另一只杯中加入30ml含1mol/L NaCl的上述缓冲液。在除尽连接管中的气泡后,在低离子强度溶液的杯子中放入一颗搅拌子。 将柱子与恒流泵相连,放松夹子,打开恒流泵,用大于5个柱体积(CV)的0。05mol/L TrisHCl pH7.3 缓冲液进行冲洗。 将缓冲液放至刚好与交换剂表面相切,加紧柱下端的夹子,取0.5ml乙醇提取液C缓慢地加到交换柱上,放松柱下端的夹子,使样品刚好全部流进交换剂内,夹紧夹子,再加3ml缓冲液.加样以后的流出液都要收集,每一管收集3ml。 将柱子与恒流泵相连,放松夹子,用恒流泵控制
12、流速为3ml/min,每管收集3ml,先用0。05mol/L Tris-HCl pH7。3 缓冲液25ml洗穿透锋,接着连接梯度发生器,进行线性梯度洗脱,直到梯度发生器内的缓冲液全部用完为止,再用0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液配制的1mol。LNaCl 溶液25ml洗脱。 再用0.5mol/L的NaCl洗3CV,再用5CV水洗,对离子交换剂进行再生。 在紫外分光光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值,画出管数与吸光度OD值的关系曲线. 在滴定板中滴2滴5%蔗糖,再加2滴待测洗脱液,用玻璃棒搅匀,放置5min,浸入葡萄糖试纸,1s后取出,60s比较颜色深浅,用“
13、+的数目表示酶活力的大小,取活力最高的23管为柱分离液D。组号23910111516活力大小+1.2.4 蔗糖酶活力的测定 取6支试管,分别按表1-1加入各种试剂。将各试管内液体混合均匀,在沸水浴中加热5min.取出后立即用冷水冷却到室温,于540nm波长处测OD值,以葡萄糖的毫克数为横坐标,OD值为纵坐标,画出标准曲线.表11 葡萄糖标准曲线的制作Form11 the form of making glucose standard curves sample试管号012345葡萄糖00.801.001。201.401.60蒸馏水3.002.202。001.801。601.403,5-二硝基水
14、杨酸 1。501。501。501.501。501。50总体积4.504.504.504.504。504.50将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释:初提液A(1:200);热提取液B(1:200);乙醇沉淀提取液C(1:200);柱分离液D(1:20).并取8支试管,按表1-2加入各种试剂。表12 酶的催化反应Form1-2 enzymes catalysis reaction项目初提液A(1:200)热提取液B(1:200)乙醇沉淀提取液C(1:200)柱分离液D(1:20)加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml2.002.002.002.002。002.002.002.00
15、2mol/L NaOH/ml0.05-0。05-0.050。05-35预热10min5蔗糖(35)/ml2.002.002。002.002.002.002。002。00加入蔗糖,立即摇匀开始计时,35准确反应3min2mol/L NaOH/ml-0。05-0.050.050。05总体积/ml4.504。504。504。504.504。504.504.50 从每管中按照表格1-3取出反应液(V测)进行还原糖的测定,方法和葡萄糖的标准曲线制作相同,如果测得的OD值不在标准曲线范围内,则可增加或减少取样量,直到OD值在标准曲线范围内为止.计算4。5ml溶液中所含还原糖的量(以葡萄糖计),用表格记录下
16、来。 蔗糖酶的活力单位定义为:在一定条件下(pH为4.6、温度为35)在3min内能水解蔗糖还原成还原糖1mg所需的酶量,称为1个活力单位。总活力单位数=mg/ V测*4。5/2V总n 式中,mg为V测体积测出的葡萄糖的毫克数;n为酶液稀释倍数;V总为各种提取液在提取过程中得到的总体积。酶的回收率=(各提取液的总酶活/处提液A的总酶活力)100%1.2.5 蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算 将试管从05号编码,按表1-3分别加入各试液.试剂A加毕混匀后,静置10min,再向各试管加试剂B后放置10min,再加第二次,每加一次均应立即迅速充分混合.完全加毕后,放置55恒温器内保温5min或室温放
17、置30min。 取出试管置冷水中冷却1min.以空白0号为对照,660nm处测定各管OD值,以牛血清蛋白微克数为横坐标。OD660值为纵坐标,用适当比例在标准坐标纸上绘制标准曲线图。 将前面所得到的四个部分提取液按照比例稀释.初提液A(1:100),热提取液B(1:100),乙醇提取液C(1:20),D不稀释,从中各取出0。5ml进行蛋白质含量测定。 从标准曲线上查知对应蛋白微克数,计算出总蛋白量和比活力。表13 标准曲线配制加样表Form 13 the form of making standard curves sample试剂量/ml所加试剂管号012345标准牛血清蛋白液/ml00.2
18、0。40.60.81。0H2O/ml4.54。34.13。93。73。5试剂A/ml1。01。01。01.01。01。0试剂B/ml第一次0.30。30。30.30.30。3第二次0.20。20。20.20。20。2总体积/ml6。06.06。06。06。06。0OD660 计算: 总蛋白=(mg/0。5)*nV总 比活力=总活力单位/总蛋白1.2.6 微量凯氏定氮法测总蛋白氮再用微量凯氏定氮法测热提取液B的总蛋白,将50ml 克氏烧瓶内加入2ml样液。然后各加硫酸钾-硫酸铜混合物约20mg 以及浓硫酸2ml。烧瓶口插一小漏斗,烧瓶置通风橱内的消化架上加热消化,开始时应该控制火力,直到消化液透
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