基于UPLC法测定酱香型白酒原辅料中5种非挥发性有机酸.pdf

DOI：10.13746/j.njkj.2023218作者简介：骆茂香，女，贵州遵义人，硕士，工程师，主要从事白酒检验检测及白酒风味物质研究，E-mail：。基于UPLC法测定酱香型白酒原辅料中5种非挥发性有机酸骆茂香1，徐兴江1，刘磊2（1.贵州省酒类产品质量检验检测院，贵州 仁怀 564500；2.茅台学院，贵州 仁怀 564500）摘要：采用超高效液相色谱法（Ultra high performance liquid chromatography，UPLC）建立了酱香型白酒原辅料（高粱、大曲）中5种非挥发性有机酸（酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸、富马酸）含量的检测方法，结果表明外标法建立的5种非挥发性有机酸的标准曲线线性关系较好，其相关系数R2不低于0.994，检出限在1.010.0 g/mL之间，加标回收率在92.4%104.1%之间，精密度在0.1%4.7%之间。该方法操作简单、稳定性好，可用于酱香型白酒原辅料中非挥发性有机酸含量的测定。关键词：酱香型白酒；原辅料；UPLC；非挥发性有机酸中图分类号：TS262.3；TS261.7文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）09-0137-04Determination of Five Non-Volatile Organic Acids in Raw andAuxiliary Materials of Jiangxiang Baijiu by UPLCLUO Maoxiang1,XU Xingjiang1and LIU Lei2(1.Guizhou Provincial Alcohol Product Quality Inspection and Testing Institute,Renhuai,Guizhou 564500;2.Maotai Institute,Renhuai,Guizhou 564500,China)Abstract:In this study a UPLC method was established for the determination of five non-volatile organic acids(tartaric acid,malicacid,lactic acid,maleic acid,fumaric acid)in the raw and auxiliary materials(sorghum,Daqu)of Jiangxiang Baijiu.The resultsshowed that the standard curves of the five non-volatile organic acids established by the external standard method had good linear re-lationship,with the correlation coefficients R2not less than 0.994.The limits of detection(LODs)were in the range of 1.0 g/mL to10.0 g/mL,the recoveries were in the range of 92.4%to 104.1%,and the precision was in the range of 0.1%to 4.7%.The meth-od is simple and stable,and can be used for the determination of non-volatile organic acids in the raw and auxiliary materials of Ji-angxiang Baijiu.Key words:Jiangxiang Baijiu;raw and auxiliary materials;UPLC;non-volatile organic acids非挥发性有机酸类物质是酱香型白酒中重要的一类风味化合物，也是形成酯类物质的前体物质1，主要由微生物利用淀粉、脂肪、蛋白质等有机物发生生化反应而生成，对酱香型白酒有重要呈味作用，其含量对白酒质量有直接影响2-3。酱香型白酒的原辅料除水以外主要为大曲和高粱，原辅料中的有机酸含量对酱香型白酒酿造过程中的微生物生长有重要调控作用4。已有文献报道，白酒中非挥发有机酸不仅是风味物质，对生理健康同样产生重要影响，可以有效对抗肠道内的病原体。常韶娜等5发现酱香型白酒中有机酸类化合物可以影响幽门螺杆菌的脲酶活性，通过降低毒性蛋白（CagA和VacA）的表达，抑制幽门螺杆菌对胃上皮细胞的损伤；孙时光等6通过分析酱香型白酒中的风味物质及功效发现，乳酸能够促进双歧杆菌的生长，调节胃肠道，促进有益酿酒科技2023年第9期（总第351期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.9(Tol.351)137137酿酒科技2023年第9期（总第351期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.9(Tol.351)菌的生长，增强免疫力、防止细胞老化，L-苹果酸具有治疗肝肺贫血、尿毒症、高血压的功效。此外，研究还发现乳酸具有降低血糖和抑菌作用，琥珀酸、酒石酸、苹果酸、富马酸等有机酸均有抗炎作用7-8。检测非挥发性有机酸的主要仪器方法有衍生化结合气相色谱法(gas chromatography,GC)及气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrome-try，GC-MS）9、离子色谱法（ion chromatography，IC）10、HPLC法11及液质联用法（Liquid Chromatog-raphy-Mass Spectrometry，LC-MS）12。相较于 GC以及GC-MS法，高效/超高效液相色谱方法可以省去繁琐的衍生化处理样品的过程，被成熟运用于非挥发性有机酸的测定。本研究采用高效液相色谱法建立了 5 种非挥发有机酸（酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸、富马酸）的检测方法，旨在快速对酱香型白酒原辅料中非挥发有机酸进行检测。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器试验样品：大曲和高粱样品均来自酱香型白酒核心产区贵州仁怀。试剂及耗材：酒石酸（99.9%），阿尔塔公司；苹果酸（99.8%），阿尔塔公司；乳酸（色标），天津精细品化工；马来酸（99.9%），阿尔塔公司；富马酸（99.9%），阿尔塔公司；甲醇（色谱纯），德国默克公司；磷酸（色谱纯），科密欧公司；超纯水（18.2 M cm）。仪器设备：漩涡振荡器（XH-B），江苏天翎公司；台式电子天平（精确度0.0001 g），赛多利公司；0.44 m滤头；离心机（TD4Z-WS），湖南湘立公司；高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1200 serise，DAD 检测器），美国安捷伦科技公司；超纯水机（Milli-Q），Millipore公司；电子天平（精度0.0001 g），赛多利斯公司。1.2实验方法1.2.1样品前处理参照赵尚碧等13样品预处理方法对样品进行前处理，试样粉碎过筛（高粱过40目筛，大曲过20目筛），使用电子天平称取高粱和大曲各5.0 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL水（或100%甲醇溶液、50%甲醇溶液），振荡器振荡 5 min 后，以3000 r/min的转速离心30 min；吸取上清液1 mL于5 mL容量瓶中，加水（或100%甲醇溶液、50%甲醇溶液）定容；最后经0.44 m微孔滤膜过滤，待测。1.2.2液相色谱条件色谱柱：C18柱（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相 A 相为 0.1%磷酸溶液，B 相为纯甲醇溶液，010 min：5B，10.5015.00 min：100B，15.1020.00 min：5B；流速：1.00 mL/min；柱温40；进样量5 L；检测器：DAD检测器；检测波长：210 nm。1.2.3标准溶液配制分别称取一定量的5种有机酸标准品，用50%甲醇水溶解定容至100 mL，配制成一定浓度的单一标准储备液，4 冷藏密封保存。5种有机酸混合标准工作液配成如表 1 的 5 个浓度梯度，现配现用。1.2.4含量计算公式C=C测VM1000式中：C所求含量，g/kg；C测仪器测得数据，g/mL；M所取样品质量，g；V定容体积100 mL。2结果与分析2.1标准曲线建立对酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸、富马酸标准工作溶液进行测定，绘制标准曲线，结果如表 2所示。从表2可以看出，酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸、富马酸5种非挥发有机酸标准曲线线性关系良好，其相关系数均大于 0.994，满足 GB/T 270252019 检测和校准实验室能力的通用要求、CNAS-CL01-A002-2020 检测和校准实验室能力表1混合标准溶液稀释浓度标准化合物酒石酸苹果酸乳酸马来酸富马酸配制浓度（g/mL）110.60015.60051.6351.0004.000221.20031.200103.2702.0001.000331.80046.800206.5403.00010.000442.40062.400413.0804.00015.0005106.000156.000826.16010.00025.0138138认可准则在化学检测领域的应用说明 等规范性技术文件所规定的标准曲线相关系数不应低于0.99的要求。2.2精密度配制了酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸和富马酸在高粱和大曲中两个浓度水平的空白样品添加溶液，分别进样6次计算精密度，从表3中可看出，5种非挥发有机酸在高粱和大曲精密度试验中变异系数在0.1%4.7%之间，满足GB/T 270252019检测和校准实验室能力的通用要求、CNAS-CL01-A002-2020 检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明 等规范性技术文件规定的精密度试验中变异系数小于7.5%的要求。2.3回收率及准确度分别在空白样品中添加酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸和富马酸标准溶液，在S1、S2、S5三个浓度水平进行回收率试验，每个浓度水平添加3个平行样，从表4中可看出，样品化合物三个浓度水平的回 收 率 在 92.4%104.1%之 间，满 足 GB/T270252019 检测和校准实验室能力的通用要求、CNAS-CL01-A002-2020 检测和校准实验室能力认可准则在化学检测领域的应用说明 等规范性技术文件规定的回收率为90%120%的要求。2.4实验样本测定采用高效液相色谱法检测到酱香型白酒中原辅料（39个高粱、32个大曲）中5种非挥发性有机酸的含量范围如表5所示。高粱中未检测到马来酸，酒石酸、苹果酸、乳酸、富马酸的含量范围分别在0.9711.839 g/kg、00.393 g/kg、0.8265.883 g/kg、00.070 g/kg之间。大曲中酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸、富马酸的含量范围分别在012.109 g/kg、1.88421.526 g/kg、5.75123.441 g/kg、0.0030.042 g/kg、0.0220.168 g/kg之间。在高粱和大曲中非挥发有机酸含量最高为乳酸（23.441 g/kg），含量最低为马来酸（0.003 g/kg）。高粱和大曲相比，表2标准曲线及检出限化合物酒石酸苹果酸乳酸马来酸富马酸线性方程y=4.17854e-1x+1.20012y=1.9565e-1x+5.38893e-1y=1.47731e-1x-6.02504e-1y=32.13594x+7.08753e-2y=33.04440 x+11.39926相关系数(r2)0.994910.999300.999890.999730.99911检出限(g/mL)2.002.0010.01.001.00表3酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸和富马酸检测方法精密度化合物酒石酸苹果酸乳酸马来酸富马酸原料高粱大曲高粱大曲高粱大曲高粱大曲高粱大曲空白添加浓度(g/mL)00000000000000000000平行测定浓度(g/mL)144.65527.308328.591118.33611.76036.22543.84622.53299.778103.096565.180257.1100.9111.8622.2131.9871.3812.1973.5782.673244.27027.066332.955118.20312.27735.54049.06924.433100.396108.708567.250258.9770.9091.8592.1931.9861.3972.1983.4642.682346.02127.500330.427117.22611.74436.10246.71323.35796.908107.048568.316257.7700.9131.8582.1871.9821.3972.2253.5572.678444.12927.150333.838118.55712.58936.85947.74723.332100.028100.968570.404259.5450.9041.8532.1911.9861.3962.2023.1652.675544.22527.400332.863117.79012.25336.13149.74324.996100.455106.260568.562259.2100.9071.8552.1831.9761.3912.2003.5652.678644.46326.919332.238116.54112.62935.81548.55524.226101.303102.993574.063258.8050.9081.8502.1801.9721.3902.2043.3612.671平均测定浓度(g/mL)44.6327.22331.82117.7812.2136.1147.6123.8199.81104.85568.96258.570.911.862.191.981.392.203.452.68精密度(%)1.60.80.60.73.21.24.53.81.52.80.50.40.40.20.50.30.40.54.70.1骆茂香，徐兴江，刘磊 基于UPLC法测定酱香型白酒原辅料中5种非挥发性有机酸139139酿酒科技2023年第9期（总第351期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.9(Tol.351)大曲中各酸含量均高于高粱。3结论研究对样品的前处理方法进行了优化，发现利用水处理样品组仪器响应较高，检测效果较好；比较液质联用仪与高效液相色谱仪检测数据，发现高效液相色谱法误差更小，实验结果更为精确。研究采用高效液相色谱建立5种非挥发性有机酸（酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸、富马酸）检测方法，结果表明利用外标法建立的5种非挥发性有机酸的标准曲线线性关系较好，其相关系数R2不低于0.994，检出限在 1.010.0 g/mL 之间，加标回收率在92.4%104.1%之间，精密度在 0.1%4.7%之间，该方法可用于酱香型白酒原辅料中非挥发性有机酸含量的测定。参考文献：1滕明德.基于特征离子分析酱香白酒中挥发性有机酸J.食品安全导刊,2022(21)：75-78.2李先贵,陈剑波,王莉,等.酱香型白酒中有机酸的分析J.酿酒科技,2019(6)：105-107.3赵爽,杨春霞,窦屾,等.白酒风味化合物及其风味微生物研究进展J.酿酒科技,2012(3)：85-88.4云敏,周洪楷.有机酸在酱香型白酒酿造过程的调控作用J.酿酒科技,2011(7)：44-46.5常韶娜,罗强,刘杰,等.酱香型白酒中有机酸类成分抗幽门螺杆菌活性及机制研究J.酿酒科技,2021(7)：29-35.6孙时光,左勇,张晶,等.酱香型白酒中的风味物质及功效J.中国酿造,2017,36(12)：10-13.7纪凤娣,魏巍,陶汇源,等.传统食醋中有机酸与人体健康J.中国酿造,2021,40(3)：11-16.8张金修,李静,郭芳文.白酒中微量成分对人体的作用J.酿酒科技,2014(10)：143.9杨会,范文来,徐岩.基于BSTFA衍生化法白酒不挥发有机酸研究J.食品与发酵工业,2017,43(5)：192-197.10唐坤甜,赵彩云,韩兴林,等.白酒味觉成分有机酸含量分析及其对酿造工艺的影响J.食品与发酵工业,2016,42(7)：202-208.11张瑞景,王浩,蔡凤娇,等.高效液相色谱法检测白酒中四种有机酸的方法研究J.中国酿造,2022,41(3)：238-242.12刘露,吴文睿,方颂平,等.UPLC-QTOF-MS法检测白酒中9种有机酸J.安徽科技学院学报,2021,35(2)：81-85.13赵尚碧,赵振宇,刘松,等.超高效液相色谱法测定酱香型白酒高温大曲中的乳酸含量J.酿酒科技,2021(6)：125-128.表4酒石酸、苹果酸、乳酸、马来酸和富马酸回收率及准确度化合物酒石酸苹果酸乳酸马来酸富马酸试验水平S1S2S5S1S2S5S1S2S5S1S2S5S1S2S5空白添加浓度(g/mL)10.60021.200106.00015.60031.200156.00051.635103.270826.1601.0002.00010.0001.0004.00025.000平行测定浓度(g/mL)110.03721.340103.21414.01433.820155.84750.23996.559824.2350.9882.0399.9580.9894.06624.63129.74720.521103.99914.43529.601155.06550.12295.155824.2471.0491.9989.9010.9533.99924.482310.44718.392104.05419.65633.988154.94247.32096.273831.8070.7351.9099.9740.9123.97324.618平均测定浓度(g/mL)10.07720.084103.75616.03532.470155.28549.22795.996826.7630.9241.9829.9440.9514.01324.577回收率(%)95.194.797.9102.8104.199.595.393.0100.192.499.199.495.1100.398.3准确度(%)-4.9-5.3-2.12.84.1-0.5-4.7-7.00.1-7.6-0.9-0.6-4.90.3-1.7表5高粱和大曲中5种非挥发有机酸含量范围项目酒石酸苹果酸乳酸马来酸富马酸含量范围(g/kg)高粱0.9711.83900.3930.8265.883000.070大曲012.1091.8841.5265.7513.4410.0030.0420.0220.168140140