非预染蛋白分子量标准-大学本科毕业.docx
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1、武汉工程大学本科毕业(设计)论文摘 要蛋白质分子量标准,即蛋白分子量Marker,是由一种或几种分子量大小已知且高度纯化的蛋白质混合而成,是广泛应用于电泳和免疫印记分析中的试验试剂。蛋白质分子量标准的主要功能是确定未知蛋白质的分子量大小,指示电泳效果及转膜的成败。相应的有三种类型的蛋白质分子量标准:非预染蛋白质分子量标准、预染蛋白质分子量标准和 Western 专用的预染蛋白质分子量标准。建立高效的、可靠的蛋白质分子量标准生产体系对蛋白质分子量标准的生产和商业化有重要价值。本课题对非预染蛋白分子量标准的制作流程及方法进行探索,以求获得满足蛋白质组学研究所需的蛋白质分子量标准,并能够熟练掌握蛋白
2、分子量Marker的制作流程。本实验预混几种已纯化好的且分子量已知的蛋白质,采用SDS-PAGE电泳的方法制作比较清晰的蛋白Marker条带。在实验中,我们主要对现有几种蛋白质进行筛选,以确定符合要求的蛋白质;探讨了点样量和点样体积对电泳条带清晰度的影响,并确定最终可用于制作Marker的蛋白质,及其合适的点样量和点样体积。结论:在实验室现有的几种蛋白质中,我们最终选用了牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶,蛋白分子量分别为66KD和14KD。预混后,在上样量为8L,即实际蛋白含量在6.4g时,凝胶电泳可呈现两条较为清晰的条带,其范围为1466KD,适用于低分子量蛋白的检测,有一定的参考价值。关键词
3、:非预染蛋白分子量标准;制备;质量控制AbstractProtein molecular weight standard, also known as protein Marker, is a mixture of one or several pure proteins whose molecular weight is known. It is a test agent which is widely used in the analysis of electrophoresis and Western blotting. The main function of protein Mark
4、er is to determine the molecular weight of an unknown protein and indicate the success or failure of electrophoresis and transfer results. There are three kinds of corresponding protein molecular weight standards such as unstained protein molecular weight standard、pre-stained protein molecular weigh
5、t marker and pre-stained protein molecular weight marker for western blot. Efficient production of protein molecular standard is crucial to commercialization of protein standard. In this communication we explore the processes and methods of non- pre-stained protein molecular weight standards, in ord
6、er to obtain suitable protein marker to meet the requirement of proteomic studies and the ability to master protein marker making processes. In this experiment we premixed several proteins purified with known molecular weight, using SDS-PAGE to produce clearer protein marker bands. We screened sever
7、al major protein of existing by SDS-PAGE experiment to determine suitable protein which meet the requirements of making protein marker; then we explored how different sample volume and the volume of spotting affect the clarity of electrophoretic bands and determined which protein can be used to make
8、 protein marker and appropriate sample volume and the volume of spotting. Conclusions: In the several proteins existing in the laboratory, we finally chose Bovine Serum Albumin (BSA) and Lysozyme, whose molecular weights are 66KD and 14KD. After premixing, when the sample volume was 6 8ul, i.e. the
9、actual protein content is 4.8 6.4ug, the gel can be rendered more clearly two bands ranging from 14KD to 66KD. For the detection of low molecular weight proteins, there is some reference value.Keywords: Unstained protein molecular weight standard; Preparation; Quantity Control目 录摘 要IAbstractII第一章 文献
10、综述11.1 蛋白分子量测定方法11.1.1 超速离心法11.1.2 SDS-PAGE电泳法21.1.3 高效凝胶过滤率法31.1.4 电喷雾离子化质谱分析31.2 蛋白Marker的分类41.2.1 非染色蛋白分子量标准41.2.2 预染蛋白分子量标准51.2.3 Western blotting专用的蛋白分子量标准61.3 蛋白分子量标准的来源与研究现状61.3.1 普通蛋白质分子量标准的研究现状71.3.2 Western blotting 专用的蛋白质分子量标准研究现状71.4 重要研究技术SDS-PAGE电泳技术91.4.1 SDS-PAGE电泳概述91.4.2 SDS-PAGE电泳
11、的原理101.4.3 SDS-PAGE电泳体系的分类111.4.4 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳111.5 主要实验内容概述12第二章 实验部分132.1实验材料、试剂及仪器设备132.1.1主要实验材料及药品132.1.2试剂配制132.1.3主要实验仪器及设备142.2实验方法142.2.1安装夹心式垂直板电泳槽142.2.2配胶及凝胶板的制备152.2.3样品的处理与加样172.2.4电泳182.2.5凝胶剥离、染色与脱色18第三章 结果与讨论193.1对现有几种蛋白样品电泳结果的分析193.2对符合要求的蛋白样品所进行的上样量梯度电泳的结果分析193.3对预混后蛋白样品所进行的上样量梯度电
12、泳的结果分析20第四章 结论与建议224.1结论224.2建议22参考文献23致 谢2412第一章 文献综述分子量大小是蛋白质主要特征参数之一。当对一种新的蛋白质进行研究时,首先应准确测定其分子量大小,然后根据分子量大小的特点,采取相应的方法进行蛋白质的分离、纯化、检测以及其它特征的研究。因此蛋白质分子量的测定方法对于蛋白质的研究具有非常重要的意义。1.1 蛋白分子量测定方法蛋白质是生理活动中最重要的物质之一,目前已成为生命科学领域研究的热门。对于蛋白质分子量的测定方法有很多,传统的研究方法是渗透压法。现在比较常用于测定蛋白质分子量的方法有:超速离心法,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(
13、SDS-PAGE),高效凝胶过滤色谱法( HPGFC) 和电喷雾离子化质谱法( ESI-MS )1。1.1.1 超速离心法超速离心的原理是:在液体介质中的颗粒会受到本身的重力和离心机产生的离心力作用,这些作用力会加快液体中颗粒的沉降速度,将样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开1。每单位引力场生物大分子下沉的速度称为沉降系数,也可用沉降速度与向心加速度之比来定义,通常用 S 表示。不同颗粒的分子量、密度、结构形状不同,沉降系数也会不同。因此常用沉降系数来命名生物分子,如某核蛋白体的沉降系数为30S,就称为30S 核蛋白体。一般蛋白质和其他生物大分子的沉降系数介于1-200S 之间。因为蛋白质
14、有特定的沉降系数,故可根据沉降系数来分离和鉴定蛋白质。S 值不同,在同一离心加速度下,沉降速度就存在着快慢差异,从而使不同物质得到分级分离。还可以利用沉降系数的差异来测定蛋白质分子量的大小。一般来说分子量大的 S 也大,分子量小的 S 也小,但分子量与沉降系数不成正比,因为沉降系数还受到蛋白质分子形状等因素的影响。用一个已知分子量的蛋白质作为参照标准,可通过公式计算无知蛋白质的分子量,但利用公式计算蛋白质分子量只适用于球状蛋白质,不适用于高度不对称性的纤维蛋白质。1.1.2 SDS-PAGE电泳法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是比较常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白
15、质分子量2。SDS-PAGE 是在电泳样品中加入含有 SDS 和 -巯基乙醇的样品处理液的一种电泳方法。SDS 即十二烷基磺酸钠,是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构,强还原剂 -巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构。蛋白样品加入样品处理液后,要在沸水浴中煮 3-5 min,使 SDS 与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构。SDS 与蛋白质结合后使蛋白质SDS 复合物上带有大量的负电荷,这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于显示电泳过程。另外样品处理
16、液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度,聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,例如通常使用的15的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是 104105,即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶,而分子量大于 105的蛋白质则难以通过凝胶孔径,这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质,需要使用低浓度如10或 7.5%的凝胶;而对于分离较小的蛋白质,使用较高浓度的凝胶可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后,通常在上面加上一层浓缩胶(约 1cm),并
17、在浓缩胶上插入样品梳,形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺浓度通常为 3-5),由于浓缩胶具有较大的孔径,各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常 pH 值较低(通常 pH = 6.8)。其作用是,在样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳,上样后即可通电开始电泳。蛋白质在电泳时,迁移率取决于蛋白质所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除,那么电泳迁移率就取决于分子的大小。分子量计算方法:以标准蛋白的分子量对数与迁移率作图或作回归方程,迁移率等于蛋白质分子迁移距离/染料迁移距离,通过样品的迁移率计算分子量。1.1
18、.3 高效凝胶过滤率法凝胶过滤法又称分子排阻法,是一种高效分离纯化蛋白质的方法。原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力4。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基,然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中,当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时,该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上,而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质,可以用适当的配体洗脱液洗脱。从凝胶过滤的原理可知,蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量,而是它的斯托克半径。利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时,标准蛋白质(已知分子量和
19、斯托克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体),否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质,则不能用此方法测定分子量。1.1.4 电喷雾离子化质谱分析超速离心法、凝胶色谱法及聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法需要样品的量大,灵敏度差,误差也很大 。近年来质谱技术飞速发展,电喷雾离子化质谱,具有灵敏度高、准确率高、重复性好等特点,能准确地测定分子量高达几万到几十万的生物大分子,已广泛应用于生命科学领域。电喷雾质谱是 80 年代末发展起来的另一种电离质谱技术它是利用蛋白质分子可在适当酸性条件下,直接在溶液中形成多电荷的气相离子从而准确测定其分子量4。这使得质谱
20、不仅可以测定小分子物质的分子量,而且也可以测定生物大分子物质的分子量,灵敏度、准确度为各种方法之首。电喷雾离子化质谱是带有电喷雾离子化系统的质谱分析法,其原理是:样品溶液经很细的进样管进入电喷雾室,在强电场的作用下,样品溶液在出口处因电荷的分离和静电引力而破碎成许多细小的带电液滴。在电场的作用下,带电液滴逆着干燥气体流动的方向,向质谱计入口处漂移,逆向的干燥气体使液滴迅速蒸发,并使液滴表面的电荷浓度增大。当库仑斥力和液滴表面张力极限值相等时,液滴就会爆裂成更小的液滴,直到液滴变得非常小。由于液滴的曲率半径很小,而它的表面电荷密度很大,结果在液滴表面形成非常强的电场,这种强电场足以从液滴中解吸出
21、离子;离子经玻璃毛细管进入压力为几托(1 托=133.322Pa)的第一真空区,在那里可以进行碰撞活化裂解,获得样品分子的碎片,从而可获得分子的结构信息。样品的分子离子和裂片离子经一系列分离器和静电透镜进入质量分析器进行质谱分析。这种电喷雾质谱法具有很高的灵敏度,且电离的分子可以带有多电荷,针对电喷雾电离所产生的多电荷状态,将多电荷状态理解为对分子质量进行多次独立的测量,并基于联立方程解的平均方法,获得对分子质量的正确估量,解决了多电荷离子信息的问题,使蛋白分子质量测量精度获得极大的提高,使质谱仪可以分析分子量高达几十万的蛋白质。1.2 蛋白Marker的分类近年来,蛋白质分子量的测定方法愈趋
22、于简单、灵敏和精准,越来越多的蛋白质的分子量被精确测出,其中一些易于获得且稳定的蛋白质专门用作未知蛋白分子量的参照物,被称作蛋白质 Marker 或蛋白质 Ladder。尤其在实验室中,可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据电泳中的已知分子量标准,来确定未知蛋白分子量。为了使实验结果更有说服力,还可以根据需要对一些天然蛋白参照物作一些修饰,以满足实验要求。总的来说,蛋白质分子量标准分为三类分别是:非预染蛋白质分子量标准,预染蛋白质分子量标准及 Western 专用的预染蛋白质分子量标准3。1.2.1 非染色蛋白分子量标准非染色的蛋白分子量标准是最简单,也是最准确的一种蛋白分子量标准。由于没有附带染料
23、分子或标记分子,所示分子量大小更接近蛋白原本的分子量大小,是精确判断蛋白分子量大小的方法。现在的蛋白Marker多数都选用预混和的Marker,方便不同大小的蛋白比对,预混的Marker通常由一组分子量已知的蛋白条带作为指示。从选择上来说,应当选择其中至少有一条条带和待测目的蛋白分子量大小相近,越接近越好。非预染的Marker的不足之处在于,在电泳中无法观察到蛋白的移动过程,只有在电泳结束后,和待测蛋白一起经过染色及脱色处理才能显示蛋白条带在凝胶上的具体位置,因此无法对实验起预示参照作用。(1) 宽分子量蛋白标准如果从实验室总体考虑的,可以选范围尽量宽,条带分布比较均匀的蛋白分子量标准,即宽分
24、子量蛋白标准,这样蛋白无论在哪个区间都容易判断,避免正好落在一段空白区的危险。(2) 高分子量蛋白标准在检测大分子量蛋白时,通常使用到高分子量蛋白标准。(3) 低分子量蛋白标准在一般的蛋白电泳中,更常用的是低分子量蛋白标准。它除了有指示蛋白大小的作用以外,还可以用作蛋白质粗略的定量。实验室用在一般蛋白电泳的低分子量蛋白标准中。低分子量蛋白标准还包括特别小的蛋白标准,比如30kD以下蛋白或者多肽的分离辨别。表1.1 常用蛋白质分子量标准参照物高分子量标准参照中分子量标准参照低分子量标准参照蛋白质分子量蛋白质分子量蛋白质分子量肌球蛋白212000磷酸化酶B97400碳酸酐酶31000-半乳糖苷酶B
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