基于IL-6、IL-8、TNF-α和COX-2表达探讨通脉化癥汤抑制AM模型小鼠炎性反应的研究.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究基于IL-6、IL-8、TNF-和COX-2表达探讨通脉化癥汤抑制AM模型小鼠炎性反应的研究张毅然1,石雅馨1,张科科2,宁婕2,李雅琳2,姚巍3,师伟3(1.山东中医药大学中医学院 济南 250014;2.山东中医药大学第一临床医学院 济南 250014;3.山东中医药大学附属医院 济南 250011)摘要:目的基于IL-6、IL-8、TNF-和COX-2表
2、达探讨通脉化癥汤抑制AM模型小鼠炎性反应的研究,从而探究通脉化癥汤治疗AM的作用机制及治疗靶点。方法采用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠AM模型,造模成功后,随机分为模型组,通脉化癥汤低剂量组、通脉化癥汤中剂量组、通脉化癥汤高剂量组和孕三烯酮组,每组10只,另设空白组10只。除空白组及模型组给予等量蒸馏水灌胃,其余各组给予对应的药物剂量干预。2月后取材,经各组子宫HE染色后观察,使用蛋白免疫印迹法(Western blot)、免疫组化法检测组织中肿瘤坏死因子(TNF-)、环氧合酶2(COX-2)的蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)
3、的表达情况来判断疗效。结果(1)HE染色:空白组子宫内膜、肌层无明显紊乱;模型组子宫内膜、肌层结构紊乱,肌层内可见腺体及间质细胞;其余各治疗组均可从不同程度上减轻子宫内膜入侵肌层的程度,其中以高剂量组及孕三烯酮组效果最显著。(2)Western blot检测及免疫组化学分析:模型组较空白组TNF-、COX-2表达明显升高(P0.05);各治疗组均可降低TNF-及COX-2的表达,抑制效果与药物浓度呈正比,以高剂量组及孕三烯酮组效果最佳(P0.05)。(3)ELISA检测:模型组IL-6及IL-8水平较空白组显著升高(P0.05),各治疗组IL-6及IL-8的表达均降低(P0.05)。结论通脉化
4、癥汤可通过下调炎症因子TNF-、COX-2、IL-6、IL-8的表达,抑制AM模型小鼠的炎性反应,其中通脉化癥汤高剂量组及孕三烯酮组在降低AM异位病灶TNF-、COX-2的表达上优于低、中剂量组,各治疗组在下调模型小鼠血清IL-6、IL-8的表达方面疗效相当,均可起到抑制炎性反应的作用。关键词:AM 通脉化癥汤 炎性反应 AM动物模型doi:10.11842/wst.20220423008 中图分类号:R285.5 文献标识码:A子宫腺肌病(Adenomyosis,AM)是指具有活性的子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫肌层内出现,引起子宫肌层增生或肥厚,从而形成以痛经、月经异常为主要症状,子宫体
5、积增大,弥漫性或局限性病灶为主要体征的一类疾病1。AM虽不属于妇科恶性疾病,但其病灶具有增殖、迁移与侵袭等肿瘤细胞的特性。目前认为其发病机制多与子宫内膜基底部内陷及组织损伤修复、苗勒管遗迹化生及成体干细胞分化、炎症刺激和上皮间质转化等密切相关,但尚无确切发病机制2。继发性痛经、月经异常、不孕等症状严重危害女性的生活和工作3。当针对AM的常规治疗手段分为介入治疗、西药治疗及手术治疗,但介入治疗效果还存在诸多争议,西药治疗常伴随明显副作用,而手术治疗则不能满足有生育计划妇女的治疗需求4。中 收稿日期:2022-04-23 修回日期:2022-08-09 山东省人民政府山东省泰山学者工程(tsqn2
6、01909185):泰山学者青年专家,负责人:师伟;国家自然科学基金委员会面上项目(81873330):基于Rho/ROCK信号通路的桂楼药对宫腔缓释给药降低AM异位内膜细胞侵袭力的研究,负责人:师伟。通讯作者:师伟,主任医师、教授,博士研究生导师,博士,主要研究方向:妇科痛证与血证的研究。1757 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 医药以其治疗方法多样、综合疗效显著、副作用少等特点,近年
7、来被广泛应用于AM的治疗中,子宫腺肌病诊治中国专家共识 指出中医中药对于缓解AM所致的痛经疗效确切5。研究证实,AM所致的痛经、月经异常和不孕与多种炎症因子及炎症刺激密切相关2。肿瘤坏死因子(TNF-)、环氧合酶2(COX-2)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)等作为主要炎症因子参与其中6。为了探究通脉化癥汤对AM炎症刺激的抑制作用,通过建立AM小鼠模型,采用HE染色法、蛋白免疫印迹法(Western Blot)、免疫组化法、酶联免疫吸附法(ELISA)等方法评价小鼠模型构建情况及通脉化癥汤对 TNF-、COX-2、IL-6、IL-8 等炎症因子的调控作用,以探求AM发病机制
8、及治疗靶点,为临床针对性地指导AM用药提供借鉴。1 实验材料 1.1实验动物随机选取出生2日的SPF级雌性ICR小鼠70只,皆由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号为SCXK(京)2016-0006。实验动物饲养于山东中医药大学附属医院SPF级动物实验中心,室内温度控制在(22.60.4),相对湿度 60%-65%,2-21 天由母鼠喂养,22日分笼,自由摄食摄水。本研究已获山东中医药大学附属医院伦理委员会批准(AWE-2021-83)。1.2实验药品药物组成如下:桂枝15 g、重楼12 g、赤芍15 g、牡丹皮15 g、炒桃仁15 g、天花粉15 g、血竭2 g、醋五灵脂9 g、茯
9、苓15 g、土鳖虫9 g、牡蛎30 g、醋鳖甲15 g、醋没药6 g、皂角刺15 g、黄芪18 g、蜜麻黄3 g、炙甘草6 g,均来自于山东中医药大学附属医院。孕三烯酮(每粒2.5 mg),华润紫竹药业有限公司生产(批号53200201);枸橼酸他莫昔芬(每片10 mg),由山东健康药业有限公司生产(批号H37022925)。1.3实验试剂Mouse Interleukin 6(IL-6)ELISA试剂盒(基因美,货号:JYM0012Mo)、Mouse Interleukin 8(IL-8)ELISA试 剂 盒(基 因 美,货 号:JYM0457Mo)、COX2 Monoclonal Anti
10、body(Proteintech,货号:66351-1-Ig)、Rabbit Anti-TNF alpha antibody(博奥森,货号:bs-0078R)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(思科捷,货号:EF0002)和 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)HRP(思科捷,货号:EF0001)。1.4实验器械及仪器1.4.1实验器械止血钳、组织剪、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、无菌棉球、无菌纱布等皆为山东中医药大学附属医院提供。1.4.2实验仪器BCS-6-SN电子秤(China,佰伦斯);ST8型低速离心机(USA,Thermo Scientific)
11、;5424R高速低温离心机(Germany,Eppendorf);Multiskan Go1510 酶 标 仪(USA,Thermo);ZNCL-BS磁力搅拌器(China,上海一科),Trans-Blot Turbo转膜仪(USA,Bio-Rad);病理组织漂烘仪(常州派斯杰医疗设备有限公司);轮转式切片机(徕卡);免疫组化笔(Vector);Powerpac通用电泳仪(USA,Bio-rad),Innotech Fluor Chem Q 成像分析系统(USA,Alpha)等。2 实验方法及分析 2.1建立动物模型使用枸橼酸他莫昔芬诱导建立AM小鼠模型7,按照2:1的比例将雌鼠与雄鼠进行原则
12、随机交配,在小鼠出生后第2-5天(出生日为第1日),滴喂5 Lg-1的花生油、卵磷脂和炼乳的混合液(体积比2 0.2 3),并按小鼠体质量加入2.7 molkg-1的他莫西芬,1-21日龄均由母鼠哺乳饲养,22日龄起与母鼠分笼。选择雌性小鼠常规饲养75天后,随机选取10只小鼠取子宫组织,见子宫组织明显扭曲变形增粗,表面可见多个突出结节。即用4%甲醛固定,石蜡包埋后选5个以上横断面切片,采用HE染色法染色后置于光镜下观察,子宫内膜结构紊乱,腺体及间质细胞侵入子宫肌层,证明造模成功。2.2分组及给药将造模成功的50只小鼠随机分为模型组、通脉化癥汤低剂量组(临床1/2倍等效用量)、通脉化癥汤中剂量组
13、(临床等效用量)、通脉化癥汤高剂量组(临床2倍等效用量)、孕三烯酮组;另设空白组,每组各10只。按照人和动物间按体表面积折算的等效剂量公式,将通脉化癥汤临床等效剂量换算成小鼠每日用药量。将方中所有药材加入1 L蒸馏水浸泡0.5 h后,煎1758 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究煮1.5 h,过滤后得到滤液,煎煮两次,合并滤液,浓缩至6.82 gmL-1(生药量)。(1)空白组:10只,予蒸馏水
14、灌胃,0.2 mL20 g-1体重,每日1次,不予特殊处理。(2)模型组:10只,予蒸馏水灌胃,0.2 mL20 g-1体重,每日1次,不予特殊处理。(3)通脉化癥汤低剂量组:10只,将药物浓度用蒸馏水稀释为1.71 gmL-1,小鼠给药量为13.6 gkg-1,每日予0.2 mL20 g-1体重中药灌胃。(4)通脉化癥汤中剂量组:10只,将药物浓度用蒸馏水稀释为3.41 gmL-1,小鼠给药量为27.2 gkg-1,每日予0.2 mL20 g-1体重中药灌胃。(5)通 脉 化 癥 汤 高 剂 量 组:10 只,药 物 浓 度为 6.82 gmL-1,小 鼠 给 药 量 为 54.4 gkg-
15、1,每 日 予0.2 mL20 g-1体重中药灌胃。(6)孕三烯酮组:10只,根据临床等效剂量,将孕三烯酮胶囊用蒸馏水配置成0.026 mgmL-1的水溶液,小鼠给药浓度为0.32 mgkg-1,每周两次予0.2 mL20 g-1体重的药液灌胃。2.3动物组织取材过程小鼠给药干预2个月后,于末次灌胃12 h后禁食,取材前2 h禁水。消毒麻醉后,逐层打开腹腔,行腹主静脉穿刺取血后于促凝管中,室温静置20 min后离心取血清,保存于-80用于后续ELISA检测;分离双侧子宫,部分置于4%多聚甲醛溶液中进行固定,以备后续HE染色及免疫组化实验;另一部分置于-80冰箱用于后续的Western Blot
16、实验。2.4检测方法2.4.1HE染色4%甲醛固定标本48 h石蜡包埋切片(切片厚度为4 m)60加热60 min二甲苯透明乙醇脱蜡水化(乙醇浓度逐级降低)苏木素染色后光学显微镜下观察伊红染色乙醇脱水(乙醇浓度逐渐升高)二甲苯透明中性树胶封片。2.4.2免疫组织化学分析4%甲醛固定标本48 h石蜡包埋切片(切片厚度为4 m)60加热60 min二甲苯透明乙醇脱蜡水化(乙醇浓度逐级降低)柠檬酸钠抗原修复(高压锅内修复液提前15 min左右煮沸备用,注意防止组织干片)内源性过氧化物酶去除(覆盖组织后室温孵育20 min)封闭(约45 min)孵育一抗(4过夜)孵育二抗30 min(孵育二抗前可滴加
17、反应增强液)DAB显色液显色(现用现配,冲洗切片终止显色)苏木素复染乙醇脱水(乙醇浓度逐级升高)二甲苯透明晾干后中性树胶封片用CellSensStandard进行图像采集。2.4.3Western Blot检测按比例混合胶水灌胶预电泳上样一阶电泳二阶电泳制造低温环境切胶裁膜转膜封闭一抗孵育过夜二抗孵育显影。2.4.4ELISA检测腹主静脉穿刺取血后置于促凝管内室温静置20 min后离心取血清,按照ELISA说明书检测指标:包被加入样品加入酶标抗体使用底物液显色终止反应结果判定,于酶标仪上在450 nm条件下检测OD值。2.5评价标准2.5.1HE染色该方法主要检验AM成模与否,若HE染色显示子
18、宫内膜结构紊乱,腺体及间质细胞侵入子宫肌层,则证实造模成功。随机选取造模后两只小鼠的子宫,立即用4%甲醛固定,石蜡包埋后选5个以上横断面切片,采用HE染色法染色后置于光镜下观察。按子宫内膜腺体与间质侵人子宫肌层的程度进行分级,即在100倍光学显微镜下进行子宫内膜腺体与间质细胞计数同时测量浸润深度,并按5级标准分级量化评分以评估 AM 的严重程度,具体分级方法:正常子宫为0 级,评 0 分;子宫内膜间质细胞侵入肌肉内层为1级,评1分;子宫内膜问质与腺体侵入肌肉内层为2级,评2分;子宫内膜间质与腺体侵人内外肌层结合带为3级,评3分;子宫内膜腺体囊性增生且浆膜层下出现结节为4级,评4分(Morit分
19、级法),以此作为AM动物模型成功建立与否的标准。图1小鼠子宫造模情况注:A:造模后;B:造模前。1759 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 2.5.2免疫组织化学分析采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对各组3个不同区域的图片进行分析,通过测量被覆上皮面积(Aera)与该面积中阳性表达的积分光密度(IOD),得到平均积分光密度(平均积分光密度=IOD/Area),平均积分光
20、密度越大,表示阳性表达程度越高。2.5.3ELISA检测以酶标仪检测所得OD值为最终记录标准。2.5.4Western blot检测采用Image J图像分析软件对Western blot的3次不同结果进行灰度值分析,以所对应的内参 GAPDH作为标准,进行数据校准。2.6数据统计采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 9.0统计软件进行分析及作图,计量资料采用均值标准差(x s)形式表示,符合正态分布的多组之间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVO),不符合正态分布的多组之间比较采用 Kruskal-Wallis H 秩和检验,以 P0.05表示差异具有统计学意义。
21、3 实验结果 本研究灌胃干预过程中,因操作不当共死亡小鼠11只,存活49只,为减少组间样本数差异引起的实验误差,各组选取5只小鼠进行实验。3.1造模情况实验开始前随机选取空白模型组各1只小鼠检验造模结果,由图1可见,造模后的小鼠子宫组织明显扭曲变形,表面可见多个突出结节。而造模前的小鼠子图2小鼠子宫横切面HE染色图(100)注:A:空白组;B:模型组;C:低剂量组;D:中剂量组;E:高剂量组;F:孕三烯酮组。图3小鼠子宫横切面HE染色图(400)注:A:空白组;B:模型组;C:低剂量组;D:中剂量组;E:高剂量组;F:孕三烯酮组。1760 Modernization of Traditiona
22、l Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究宫组织光滑平整流畅,未见变形,表面未见突出结节(见图1)。3.2HE染色结果小鼠分组情况对评分医师置盲后由2名病理科医师独立对HE染色切片进行评分(见图2和图3),正态性检验后结果提示 HE 染色评分服从非正态分布(shapiro-wilk test=0.81,P0.001),各组评分以中位数(百分位数 P25-百分位数 P75)展示。结果如下(见表1):药物治疗组HE评分相较于模型组HE评分显著下降(Wilcox
23、on test:W=148.00,P=0.005)。3.3COX-2、TNF-免疫组化结果图4可见,模型组COX-2的表达显著高于空白组(P0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量组和孕三烯酮组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);与低、中剂量组比较,高剂量组与孕三烯酮组有显著性差异(P0.05)。图 5 可见,模型组 TNF-表达显著高于空白组(P0.05);与模型组比较,低、中、高剂量组及孕三烯酮组表达程度显著降低(P0.05),高剂量组及孕三烯酮组较低中剂量组下调作用明显,差异均具有统计学意义(P0.05)。3.4COX-2和TNF-的Western Blot结果图 6可见,模型组
24、 COX-2、TNF-表达较空白组明显升高(P0.05),低、中、高剂量组和孕三烯酮组较图4COX-2免疫组化结果比较注:A:空白组;B:模型组;C:低剂量组;D:中剂量组;E:高剂量组;F:孕三烯酮组;与空白组相比,*P0.05;与模型组相比,#P0.05;与低剂量组相比,P0.05;与中剂量组相比,P0.05。图5TNF-免疫组化结果比较注:A:空白组;B:模型组;C:低剂量组;D:中剂量组;E:高剂量组;F:孕三烯酮组;与空白组相比,*P0.05;与模型组相比,#P0.05;与低剂量组相比,P0.05;与中剂量组相比,P0.05。表1HE染色评分结果组别空白对照组孕三烯酮组模型组低剂量组
25、中剂量组高剂量组HE染色评分0.0(0.0-0.0)0.0(0.0-0.0)4.0(4.0-4.0)4.0(3.0-4.0)1.5(1.0-3.0)1.0(1.0-1.5)1761 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 模型组明显降低(P0.05);高剂量组和孕三烯酮组较低、中剂量组存在统计学差异(P0.05)。3.5IL-6、IL-8的血清ELISA结果由图 7 可见,与空白组对比,模型组血
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