荭草苷抑制PERK_ATF4_CHOP通路改善癫痫小鼠认知功能障碍机制.pdf
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1、CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023荭草苷抑制PERK/ATF4/CHOP通路改善癫痫小鼠认知功能障碍机制尹珊珊,马红,姜琦青海红十字医院小儿内科,青海 西宁810000【摘要】目的探索荭草苷抑制PERK/ATF4/CHOP通路改善癫痫小鼠认知功能障碍的机制。方法腹腔注射东莨菪碱与盐酸匹鲁卡品,建立癫痫小鼠模型。小鼠随机分为5组:对照组、模型组、荭草苷(50 mg/kg)组、MK-28(PERK激活剂,1 mg/kg)组、荭草苷(50 mg/kg)+MK-28(1 mg/kg)组,分组给药后,观察小鼠癫痫发作情况;Morris水
2、迷宫检测认知功能;TUNEL染色检测海马神经元凋亡率;ELISA测量血清COX-2、IL-18及IL-6水平;免疫印迹法检测海马组织凋亡及PERK/ATF4/CHOP通路蛋白表达。结果荭草苷组小鼠发作次数及持续时间、逃避潜伏期、海马神经元凋亡率、血清COX-2、IL-18及IL-6水平、海马组织Caspase-3、Bax、ATF4、CHOP蛋白表达及p-PERK/PERK相比模型组和荭草苷+MK-28组均降低(P0.05),MK-28组小鼠各指标变化趋势与荭草苷组相反。结论荭草苷可通过抑制PERK/ATF4/CHOP通路激活阻止炎症,减轻癫痫小鼠海马神经元凋亡,改善其认知功能。【关键词】荭草苷
3、;PERK/ATF4/CHOP;癫痫;认知功能障碍【中图分类号】R741【文献标识码】A【DOI】10.13418/j.issn.1001-165x.2023.5.13Mechanism of Orientin in improving cognitive impairment in epileptic mice by inhibiting PERK/ATF4/CHOP pathwayYin Shanshan,Ma Hong,Jiang QiDepartment of Pediatrics,Qinghai Red Cross Hospital,Xining 810000,Qinghai Pro
4、vince,China【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of orientin in improving cognitive impairment inepileptic mice by inhibiting PERK/ATF4/CHOP pathway.MethodsThe epilepsy mouse model wasestablished by intraperitoneal injection of scopolamine and pilocarpine hydrochloride.The mice wererandomly di
5、vided into five groups:control group,model group,orientin(50 mg/kg)group,MK-28(PERKactivator,1 mg/kg)group,orientin(50 mg/kg)+MK-28(1 mg/kg)group.After grouping,the epilepticseizures of the mice were observed.Morris water maze test was used to detect the cognitive function of mice.TUNEL staining was
6、 used to detect the apoptosis rates of hippocampal neurons of mice.ELISA was used tomeasure the levels of serum COX-2,IL-18 and IL-6 of mice.Western blotting was used to detect theexpression of apoptosis and PERK/ATF4/CHOP pathway protein in the hippocampus of mice.Results Thenumber and duration of
7、attacks per day,escape latency,hippocampal neuronal apoptosis rate,serum COX-2,IL-18 and IL-6 levels,and hippocampal tissue caspase-3,Bax,ATF4,CHOP protein expression and p-PERK/PERK in the orientin group were lower than those in the model group and the orientin+MK-28 group(P0.05),the change trend o
8、f each index in MK-28 group was opposite to that in orientin group.ConclusionsOrientin can inhibit the activation of the PERK/ATF4/CHOP pathway to prevent inflammation,reduce theapoptosis of hippocampal neurons in epileptic mice and improve their cognitive function.【Key words】Orientin;PERK/ATF4/CHOP
9、;Epilepsy;Cognitive function dysfunctionCorresponding author:Yin Shanshan,E-mail:【收稿日期】2022-04-11【基金项目】青海省科技计划项目(2019-ZJ-T06)【作者简介】尹珊珊(1983-),女,主治医师,研究方向:小儿内科相关基础研究,E-mail:癫痫是一种常见的需长期治疗的慢性神经系统疾病,因脑神经异常放电引发神经炎症、神经元变性丢失、胶质细胞功能改变等病理变化,导致抽搐、意识模糊、精神异常等症状,反复发作,形成持续的脑损伤,随病情进展,会损害患者学习记忆能力,造成认知功能障碍1,2。癫痫患者存在
10、慢性炎症与氧化应激增强等病理状态。研究表明,氧化应激和炎症反应是导致癫痫患者神经元损伤的重要原因,减轻神经炎症,减弱氧化应激,可改善癫痫导致的认知功能障碍2,3。PERK/ATF4/CHOP 是调控内质网应激的重要信号之一,参与介导缺血性脑卒中后神经元凋亡过程,抑制该信号激活,可显著减轻内质网应激,有效降低缺氧缺糖诱导的神经元凋亡4。内质网应激导致的神经元死亡在癫痫发病过程中起关键作用5,抑制 PERK磷酸化可以减轻癫痫发作大鼠神经元的凋亡,缓解其癫痫发作症状6,因而 PERK/ATF4/CHOP 可作为治疗癫痫小鼠认知功能障碍的潜在作用靶点。荭草苷是广泛存在于金莲花、乌蕨、竹叶等多种药用植物
11、中的 实验研究 578中国临床解剖学杂志 2023 年第 41 卷第 5 期天然黄酮类化合物,具有消炎镇痛、抗病毒、抗氧化、抗菌等药理作用,可减少转基因小鼠海马组织中 A沉积,提升其认知功能,因而推测荭草苷可改善癫痫小鼠认知功能障碍7,8。本文构建癫痫模型小鼠,探索荭草苷通过抑制 PERK/ATF4/CHOP 通路改善癫痫小鼠认知功能机制。1材料与方法1.1材料1.1实验动物SPF 级 BALB/C 雄性小鼠,体质量2025 g,购于南京拉姆达医药有限公司,生产合格证号 SYXK(苏)2017-0040,分笼饲养于本院屏障环境动物房,温度2326,湿度50%55%,12 h/12 h明暗交替循
12、环,自由饮水进食。1.2主要试剂及仪器荭草苷(纯度 99.6%,批号FY13240922)购 于 南 通 飞 宇 生 物 科 技 有 限 公 司;PERK 激 活 剂 MK-28(货 号 HY-137207)购 于 美 国MedChemExpress 公司;东莨菪碱(纯度 95%99%,货号CFN98200)购于武汉中标科技有限公司;盐酸匹鲁卡品(货号 P6503)购于美国 sigma 公司;地西泮注射液(规格2 mL:10 mg,国药准字H12020957)购于天津金耀药业有限公司;TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒(货号 G002-1-2)、BCA 法总蛋白定量测定试剂盒(A045-3-2
13、)、COX-2 试剂盒(货号 H200)、IL-6 测试盒(货号 H007)、IL-18测试盒(货号 H015)、高强度 RIPA裂解液(W062-1-1)购于南京建成生物工程研究所;羊抗兔二抗(货号 ab150077)、兔源-tubulin 一抗(货号ab6046)、兔源 CHOP 一抗(货号 ab11419)、兔源 ATF4一 抗(货 号 ab216839)、兔 源 PERK 一 抗(货 号ab229912)购于美国 Abcam 公司;兔源 p-PERK 一抗(货号bs-3330R)购于上海恪敏生物科技有限公司;兔抗小鼠 Caspase-3 一抗(AF0081)、兔抗小鼠 Bax 一抗(A
14、F0057)购于上海碧云天生物技术有限公司等。SA201Morris 水迷宫视频分析系统购于江苏赛昂斯生物科技有限公司;HBS-ScanX全波长酶标仪购于南京德铁实验设备有限公司;CKX41 光学显微镜购 于 日 本 Olympus 公 司;RM2245 切 片 机、HistoCoreArcadia 石 蜡 包 埋 机 购 于 德 国 LeicaBiosystems 公 司;1658033 垂 直 电 泳 转 印 系 统、ChemiDoc XRS凝胶成像仪购于美国Bio-Rad公司等。1.2研究方法1.2.1制备癫痫小鼠模型及分组给药参考文献制备癫痫小鼠模型9:小鼠腹腔注射东莨菪碱(2 mg/
15、kg),30 min 后腹腔注射盐酸匹鲁卡品(300 mg/kg),参照Racine量表对小鼠癫痫发作严重程度进行评分,小鼠眨眼、节律性咀嚼且面部抽搐评 1 分,点头评 2分,单侧前肢阵挛评 3 分,双侧前肢阵挛评 4 分,摔倒、失去平衡评 5 分,2 h 内小鼠癫痫评分3 分,且发作 3次及以上,视为构建模型成功,2 h后腹腔注射地西泮(5 mg/kg)终止小鼠癫痫发作。将造模成功小鼠随机分为模型组、荭草苷(50 mg/kg)组、MK-28(1 mg/kg)组、荭草苷(50 mg/kg)+MK-28(1 mg/kg)组,每组12 只,另取 12 只 BALB/c 小鼠,以同样方法腹腔注射同剂
16、量生理盐水,作为对照组。将荭草苷和 MK-28 分别混入生理盐水中,搅拌溶解,配成 10 mg/mL 的荭草苷药液10、0.2 mg/mL 的MK-28药液11,荭草苷+MK-28组小鼠腹腔注射5 mL/kg的荭草苷药液,同时皮下注射 5 mL/kg的 MK-28药液;荭草苷组小鼠腹腔注射 5 mL/kg 的荭草苷药液,同时皮下注射 5 mL/kg 的生理盐水;MK-28 组小鼠腹腔注射 5 mL/kg 的生理盐水,同时皮下注射 5 mL/kg的 MK-28 药液;模型组、对照组小鼠腹腔注射 5 mL/kg 的生理盐水,同时皮下注射 5 mL/kg 的生理盐水,每天给药1次,持续28 d。1.
17、2.2检测小鼠癫痫发作情况给药结束后 24 h,每组选出6只小鼠,视频监测其行为,记录1 d内从7:30到19:30癫痫发作次数及持续时间,计算出均值。1.2.3检测小鼠认知功能癫痫监测结束次日早晨进行 Morris 水迷宫实验。准备一个高 20 cm 平台且注水的水池(直径 2 米,水深 22 cm,分为 4 个象限),将小鼠放入每个象限正中,训练其寻找平台,5 d后检测记录小鼠自每个象限正中出发找到平台的时间,取平均值作为逃避潜伏期,120 s 内找不到平台者逃避潜伏期记为120 s。1.2.4检测小鼠海马神经细胞凋亡率及收集标本Morris 水迷宫实验结束后,马上以乙醚麻醉小鼠,以注射器
18、自颈动脉采血约 1.2 mL,离心(3000 rpm/min,15 min,4),将上清分组转移至干净Ep管中,-80 储存,然后颈椎脱臼处死小鼠,剥离大脑,摘取 0.7 g脑组织,液氮储存;剩余的大脑组织经固定、脱水、透明、包埋、切片后,选出含有典型且完整的海马组织结构的切片脱蜡、水化,TUNEL 染色,脱水、透明、封片分析海马神经细胞凋亡率。1.2.5检测小鼠血清致炎因子 COX-2、IL-18、IL-6 含量取出 1.2.4 中的血清,将其置于冰水浴中解冻,ELISA测定COX-2、IL-18、IL-6含量。1.2.6检测小鼠海马组织 PERK/ATF4/CHOP 通路蛋白表达取出 1.
19、2.4 中的脑组织,置于含有适量蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液中匀浆,离心匀浆液(3000rpm/min,20 min,4),采用 BCA 法测量上清中蛋白总浓度,煮沸变性后,取 20 mg 各组总蛋白经电泳分离,然后经湿转后移到硝酸纤维素上,接着将膜浸没入 5%脱脂奶粉溶液中室温孵育,2 h 后取出,将Caspase-3、Bax、PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、-tubulin 5 种蛋白条带裁下,一抗孵育(4,10 h)、洗 579CHINESE JOURNAL OF CLINICALANATOMY VOL.41 NO.5 2023膜(TBST 缓冲液,3 次,5 min/次
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