《westernblot精华》.ppt
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1、Western blot 实验技术 1精选课件ppt定义:n印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。nWestern Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。n1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。n而后人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easte
2、rn印迹法2精选课件pptWestern Blot基本原理基本原理 Western BlotWestern Blot:采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物 是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。3精选课件pptWestern Blot一般流程n蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰
3、胺 凝胶电泳l 转膜l 封闭l 一抗杂交l 洗涤l 二抗杂交l 洗涤l 底物显色4精选课件ppt?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。细胞裂解液细胞裂解液细胞裂解液细胞裂解液:0.5ml0.5ml水水+0.5ml+0.5ml裂解液裂解液+10+10ll蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂+1010l l 泛酸钠泛酸钠+1 1l l
4、 pepstainpepstain有机溶剂提取法有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。丙酮和丁醇等。?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的制备蛋白样品的制备5精选课件ppt细胞数量达细胞数量达5105106 6个时就可以做个时就可以做WBWB。将细胞裂解液再离心,收集上清液将细胞裂解液再离心,收集上清液测蛋白浓度(测蛋白浓度(BcaBca法)法),统一上样量统一上样量加加loading BUFFER loading BUFFER 煮样煮样5min-1
5、0min5min-10min蛋白样品制备的注意事项:蛋白样品制备的注意事项:煮沸5-15min,以充分变性蛋白,保证蛋白从空间结构变为一级结构(多聚体解散为单聚体,氧化状态转化为还原状态等)。有的也可以在700C加热5-10min,尤其适用于多次跨膜蛋白的检测(这些蛋白在煮沸状态下容易聚集,而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。)6精选课件pptSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理原理:SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS
6、的平均结合量是 1:1.4(以重量为单位),而蛋白质和SDS结合后,由于 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量的蛋白质带电价一致(charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素7精选课件ppt8精选课件pptM纯净水(ddH2O)M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 (Arc-Bis)MSDSMTris-HCLM四甲基乙二胺(TEMED)(催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合)M过硫酸铵(APS)(提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基)凝胶成份凝胶成份9精选课件ppt分离胶(12%)浓缩胶(4%)ddH2O4.95m
7、l3.05mlArc-Bis6ml0.67mlTri-HCl3.75ml(PH=8.8)1.25ml(PH=6.8)10%-SDS150ul50ul10%-APS150ul50ulTEMED15ul10ul常用凝胶配置比例10精选课件ppt凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度(W/V)分离范围(KD)3.55.0100-200080-5008.012.060-40040-20015.020.025-1506-10030.06以下11精选课件pptSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项:聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项:做胶:防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)。加样:加样
8、量一样,加样时间要尽量短,以免样品扩散 电泳:将胶夹好放于电泳槽中,加电泳buffer,将电压调到90V开始电泳,待样品在积层胶里压成一条直线之后,将电压调到120V,直到溴酚兰前沿跑出胶后停止电泳。12精选课件ppt转膜转膜膜的选择膜的选择膜的选择膜的选择聚偏二聚偏二氟乙烯膜氟乙烯膜(PVDFPVDFPVDFPVDF)硝酸纤硝酸纤硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜维素膜维素膜(NCNCNCNC)需要用甲醇浸泡需要用甲醇浸泡需要用甲醇浸泡需要用甲醇浸泡简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格昂贵价格便宜价
9、格便宜价格便宜价格便宜13精选课件ppt膜的选择14精选课件ppt转膜半干法半干法(用恒流)将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间,电转1030min。湿法湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸泡在转移装置的缓冲液中,电转1h或过夜。15精选课件ppt转膜注意事项(一)转膜注意事项(一)泡膜:泡膜:转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移bufferbuffer浸泡浸泡20min20min (1.1.凝胶凝胶若是没在预冷的转膜若是没在预冷的转膜bufferbuffer中浸泡,就会在转膜过程中出现中浸泡,就会在转膜过程中出现凝胶皱凝胶皱缩缩,导致出现,
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