基于“脾主运化”理论探讨芪药鸡金粥通过PI3K_Akt_NF-κB通路防治化疗致胃肠黏膜损伤的机制.pdf

基于“脾主运化”理论探讨芪药鸡金粥通过/通路防治化疗致胃肠黏膜损伤的机制翁美华邓丽金胡静温周红娟陈锦秀陈焰南(.福建中医药大学福建 福州.厦门大学附属中山医院福建 厦门.四川大学华西医院四川 成都)摘要 目目的的 探讨“脾主运化”理论在芪药鸡金粥防治化疗致胃肠黏膜损伤的指导意义及其作用机制 方方法法 只雄性 大鼠常规适应性喂养 后随机分为空白组、模型组、药膳组每组 只 药膳组于实验第 天开始给予芪药鸡金粥灌胃模型组及空白组给予白粥灌胃均 次/每次 /()连续 实验第 天各组灌胃 后药膳组和模型组大鼠给予氟尿嘧啶注射液 /一次性腹腔注射空白组给予等量生理盐水注射 分别于实验第 天和实验第 天每组各取 只大鼠处死 染色观察回肠组织病理形态 法检测回肠组织中封闭蛋白()、闭锁蛋白()、结合黏附分子()、闭锁小带蛋白()、磷脂酰肌醇 激酶()、蛋白激酶()、蛋白表达情况 结结果果 实验第 天和第 天模型组和药膳组大鼠回肠组织中 、蛋白相对表达量均明显低于同期空白组(均 .)但药膳组 、蛋白相对表达量均明显高于同期模型组(均.)结结论论 基于“脾主运化”理论的芪药鸡金粥可调节化疗大鼠肠道紧密连接蛋白的表达保护肠道机械屏障的结构与功能机制可能与抑制/信号通路激活相关关键词 脾主运化芪药鸡金粥胃肠黏膜损伤紧密连接蛋白磷脂酰肌醇 激酶蛋白激酶:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 翁美华女硕士研究方向为中西医结合康复护理通信作者 陈焰南 :.基金项目 福建省自然科学基金项目()/“”(.):“”./()./现代中西医结合杂志 ().()()()().(.)(.).“”/.:化疗致胃肠道黏膜炎()又称化疗致胃肠道黏膜损伤是许多化疗药物的剂量限制性不良反应之一病理学上以胃肠上皮细胞凋亡为特征 据报道在接受标准剂量化疗后大约 的患者和 接受骨髓或干细胞移植高剂量化疗的患者会出现 及其相关并发症可导致化疗剂量减少影响癌症患者总体生存率增加了患者医疗负担降低患者生活质量 中医学认为脾胃气虚、脾失健运是 的基本病机纠正脾胃气虚以健运脾胃恢复脾主运化功能是 防治的重要途径 脾主运化是指脾将饮食水谷消化成精微物质与糟粕并将精微物质吸收转输到全身各脏腑的生理功能包括运化水谷和运化水液两个方面芪药鸡金粥具有益气健脾功效临床应用发现可减轻化疗后胃肠道反应 动物实验研究证实芪药鸡金粥可上调肠道紧密连接蛋白表达保护肠道机械屏障的结构与功能从而改善 其作用机制可能与活化细胞外信号调控激酶()/丝裂原活化蛋白激酶()信号通路、抑制脊髓 样受体()/核因子()信号通路下游的关键蛋白 降解有关但未找到芪药鸡金粥经 通路抑制 降解的证据 既往研究表明磷脂酰肌醇 激酶()/蛋白激酶()/信号通路是调控肠黏膜炎症的关键通路是健运脾胃的重要作用靶点 因此本研究以“脾主运化”作为理论基础以 脾气虚大鼠为研究对象基于/信号通路探讨了芪药鸡金粥调控 肠道紧密连接蛋白表达的机制以进一步明确芪药鸡金粥的作用机制为其临床防治 提供理论依据 实验材料与方法 实验动物健康 级雄性 大鼠 只 周龄体重()购自上海西普尔 必凯实验动物有限公司实验动物合格证号:(沪)大鼠饲料为福建中医药大学实验动物中心统一配制单笼喂养自由饮食环境温度 相对湿度 每天人工光源 明暗交替 药膳及药品 芪药鸡金粥(黄芪、淮山、莱菔子 、鸡内金 、粳米 )其中黄芪产自山西淮山产自河南鸡内金、莱菔子和粳米产地不限所有药膳原材料均购自福建中医药大学国医堂中药房 氟尿嘧啶注射液(上海旭东海普药业有限公司国药准字)主要试剂 封闭蛋白()兔多克隆抗体、闭锁蛋白()兔多克隆抗体、闭锁小带蛋白()兔多克隆抗体、结合黏附分子 ()兔多克隆抗体(福州沃森生物公司货号分别为 、)鼠单克隆抗体、鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体、多克隆抗体、鼠单克隆抗体(福州沃森生物公司货号分别为 、)动物细胞总蛋白抽提试剂(碧云天)蛋白定量试剂盒(碧云天)增强型化学发光底物检测试剂盒(现代中西医结合杂志 ()上样缓冲液(碧云天)主要仪器温控摇床()电子天平(德国赛多利斯公司)恒温水槽 型(上海精宏设备有限公司)超低温冰箱(美国 公司)移液枪(公司法国)微量加样吸头(美国)低温冰箱(青岛海尔)制冰机(美国)去离子水仪(美国)膜(美国)超高灵敏化学发光成像系统、电泳仪、凝胶玻璃板、固定夹、垂直电泳槽、转移槽(美国 公司)通用显影粉、酸性定影粉(天津天陆海感光材料厂)转移脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司)高速离心机、低温离心机(德国)药膳及白粥制作方法依据中国药膳制作及从业资质基本要求 标准(编号/)参照中医药膳学制作 芪药鸡金粥制作方法:放入药材后加水 浸泡 武火煎煮 取汁加入粳米煮熟后滤液、浓缩(每毫升药液含生药.)储存 白粥制作方法:淘洗过的粳米 加水 武火煎煮 改用文火熬至汤汁浓稠煮熟后滤液、浓缩 储存 实验方法 大鼠常规适应性喂养 后采用随机数字表法完全随机分为空白组、模型组、药膳组每组 只采用 苦味酸及.中性品红溶液标记动物 药膳组于实验第 天:开始给予芪药鸡金粥灌胃(复温至 )模型组及空白组给予白粥灌胃均 次/每次 /()(参照人鼠体表面积换算灌胃剂量人按照 计算)连续 灌胃方法:将大鼠固定于左手头颈保持平直右手持装有药膳或白粥滤液的注射器将针头沿大鼠左侧口角徐缓经口腔插入约 将药液徐徐推注进胃内 实验第 天各组灌胃 后药膳组和模型组大鼠给予 /一次性腹腔注射空白组给予等量生理盐水注射实验第 天(化疗后第 天)组各随机抽取 只大鼠禁食 后处死其余大鼠继续灌胃 实验第 天(化疗后第 天)剩余大鼠经禁食 后处死 检测指标及方法 回肠组织病理形态大鼠禁食禁水 后脱颈椎法处死打开腹腔解剖取出小肠使用生理盐水将小肠内容物冲洗干净后于距回盲部约 处剪取回肠 生理盐水冲洗干净后立即置于多聚甲醛固定 常规制备石蜡切片染色光镜下观察 回肠组织中紧密连接相关蛋白和/通路相关蛋白表达情况 采用 法检测:取 冻存的回肠组织用等量的蛋白样本()进行 凝胶电泳湿法转膜在 脱脂奶粉封闭液中封闭(过夜)弃去封闭液 加入封闭液稀释好的 、蛋白抗体及 抗体()漂洗滤膜 次每次 将膜与辣根过氧化酶标记的二抗()室温下摇荡孵育 然后用 充分洗膜漂洗 次每次 显影液置膜上凝胶成像仪成像测定各条带的灰度值 目的蛋白的灰度值与 的比值代表目的蛋白的相对表达量 统计学方法应用 .软件进行数据录入和分析 符合正态分布计量资料用均数 标准差()表示不符合则用中位数()及四分位间距()表示 若资料符合正态分布且满足方差齐性则先采用单因素方差分析再选用 法行多组间两两比较若资料不符合正态分布或符合正态分布但方差不齐则采用 检验再进一步用 法做两两比较 .为差异有统计学意义 结 果 各组大鼠回肠组织病理形态实验第 天空白组大鼠回肠黏膜绒毛结构完整未出现充血、水肿、剥脱和炎性细胞浸润现象上皮细胞连接紧密腺体形状规则模型组大鼠回肠黏膜绒毛变性、萎缩部分绒毛脱落完整性受破坏有大量炎性细胞浸润腺体被破坏药膳组与模型组相比回肠黏膜绒毛结构相对完整绒毛脱落现象有所恢复炎性细胞浸润减少 见图 各组大鼠回肠组织中紧密连接蛋白表达情况实验第 天和第 天模型组和药膳组大鼠回肠组织中 、蛋白相对表达量均明显低于同期空白组(均.)但药膳组 、蛋白相对表达量均明显高于同期模型组(均.)见图、图 及表 现代中西医结合杂志 ()图 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织病理形态(染色)图 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织中紧密连接蛋白表达情况图 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织中紧密连接蛋白表达情况表 空白组和化疗各组大鼠回肠组织中紧密连接蛋白相对表达量比较()组别只数实验第 天 实验第 天 空白组.模型组.药膳组.注:与空白组比较.与药膳组比较.各组大鼠回肠组织中/通路相关蛋白表达情况 实验第 天和第 天模型组和药膳组大鼠回肠组织中、蛋白相对表达量均明显低于同期空白组(均 .)但药膳组、蛋白相对表达量均明显高于同期模型组(均.)见图、图 及表、表 讨 论化疗药物属热毒之邪在对抗癌瘤的同时容易图 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织中/通路相关蛋白表达情况现代中西医结合杂志 ()图 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织中/通路相关蛋白表达情况耗伤人体气血、灼津耗液使机体气血俱损伤及脾胃从而导致脾胃气虚失之健运 本研究所用芪药鸡金粥是益气健脾经典药膳记载于唐代医家昝殷食医心鉴其组成中黄芪为补气诸药之最性微温味甘入脾、肺经有益气健中、补养脾胃之气功效可增强机体免疫功能淮山性味甘平入脾、肺、肾经具有健脾益胃、滋肾益精等作用辅助黄芪以补脾胃之气鸡内金、莱菔子助脾胃之健运防黄芪、淮山之壅滞共奏益气健脾、消食导滞之效使药膳补 而不滞补中寓通粳米性平、味甘淡具有健脾表 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织中/通路相关蛋白相对表达量比较()组别只数 空白组.模型组.药膳组.注:与空白组比较.与药膳组比较.表 空白组和化疗各组大鼠实验第 天回肠组织中/通路相关蛋白相对表达量比较()组别只数 空白组.模型组.药膳组.注:与空白组比较.与药膳组比较.胃、补中气之效 芪药鸡金粥切中 的病因以及脾胃气虚失之健运的病机肠道屏障由机械、免疫、生物和化学四大屏障构成其中机械屏障为肠道屏障最重要的组成部分主要由肠黏膜上皮细胞、上皮细胞间紧密连接和菌膜三部分组成 机械屏障完整可以有效阻止细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜进入组织 当肠黏膜受到化疗药物的刺激时其紧密连接结构会被破坏损伤肠道屏障功能导致肠道内各种抗原激活黏膜固有层的免疫系统启动过度持续的免疫炎症反应造成肠黏膜损伤 紧密连接蛋白是肠道屏障功能的重要组成部分/通路在调控紧密连接蛋白合成过程中发挥重要作用 在/信号通路中 参与紧密连接的形成过程促进骨架蛋白重排 可与 和 的 端结合影响紧密连接的闭合活化的 启动基因转录与炎症反应使紧密连接蛋白分布异常和表达下降增加肠道的通透性破坏肠道黏膜屏障进而加重肠道损伤 本实验结果显示实验第 天模型组大鼠回肠黏膜绒毛变性、萎缩部分绒毛脱落完整性受破坏有大量炎性细胞浸润腺体被破坏药膳组回肠黏膜绒毛结构相对完整绒毛脱落现象有所恢复炎性细胞浸润减少 实验第 天和实验第 天模型组回肠组织中紧密连接蛋白 、蛋白相对表达量均明显低于空白组药膳组各蛋白相对表达量也降低但下降程度明显轻于模型组这说明化疗药物 能显著影响大鼠肠黏膜紧密连接蛋白的表达破坏肠道机械屏障防护功能芪药鸡金粥可在一定程度上通过上调肠道机械屏障紧现代中西医结合杂志 ()密连接蛋白的表达而缓解回肠黏膜损伤研究显示/信号通路参与了胃肠黏膜损伤的发生发展对其进行调控是修复胃肠黏膜的关键 是一系列胞内传导酶家族 则是一种与蛋白激酶 相关的丝氨酸或苏氨酸激酶是 下游的直接作用靶点 当所有位点被磷酸化细胞膜上的 就被完全激活被激活的 从细胞膜释放进入细胞浆或细胞核中进行信号的传输执行其生物学功能 因此 的磷酸化可被作为判断 活性的指标 由活化的/激活能够起到多向性的调节作用可调节免疫炎症相关的多种细胞的基因表达 研究显示在正常状态下 与其抑制分子 结合存在于细胞质中当细胞受到外界信号(如化疗药物、脂多糖等)刺激时通路上的 被活化 可促使下游 发生磷酸化而与 解离此时 被激活而移位进入细胞核内与 上相应位点结合发挥生物学效应加重炎症反应 本实验结果显示实验第 天和第 天模型组和药膳组大鼠回肠组织中、蛋白相对表达量均低于空白组但药膳组各通路蛋白下降的程度轻于模型组 这说明当肠黏膜受到化疗药物刺激时/信号通路被激活使通路蛋白、表达降低而益气健脾芪药鸡金粥能够一定程度上抑制/信号通路的激活减轻炎症反应从而减轻肠道黏膜损伤综上所述芪药鸡金粥可以调节肠道紧密连接蛋白表达减轻化疗后胃肠黏膜损伤其机制可能与抑制/信号传导阻断 信号级联激活抑制炎症细胞因子介导有关 但药膳复方成分复杂可能作用于疾病相关的不同靶点是否对/信号通路具有特异性抑制作用尚不完全确定有待进一步研究从而为益气健脾药膳改善化疗后胃肠黏膜损伤提供更系统、明确的分子理论依据利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .():./.:.:.():.():.林平联.芪药鸡金粥预防胃癌化疗胃肠道反应的效果研究.福州:福建中医药大学.谢丽霞陈锦秀吴小玉.芪药鸡金粥对化疗大鼠胃肠黏膜机械屏障损伤的保护作用.护理学杂志():.陈婷玉陈锦秀谭景予等.不同剂量芪药鸡金粥对氟尿嘧啶所致大鼠胃肠黏膜损伤的影响.护理学杂志():.蒋寅.黄芩苷对溃疡性结肠炎/信号通路的影响及其机制研究.南京:南京中医药大学.薛明松郑玉玉张宇峰等.黄连粗多糖协同小檗碱改善溃疡性结肠炎肠黏膜屏障损伤的作用.中国实验方剂学杂志():.谢梦洲朱天民.中医药膳学.北京:中国中医药出版社.徐平.实验动物管理与使用操作技术规程.上海:上海科学技术出版社:.():.秦环龙.肠屏障功能的基础与临床.上海:上海交通大学出版社.:.:./.:.杨彬彬崔宁张亚楠等.黄芪多糖对脾虚湿困大鼠胃肠功能的调节及肠黏膜损伤修复的机制研究.中国医药导报():.(下转第 页)现代中西医结合杂志 ()流速改善肾脏微循环和肾脏组织的血流灌注改善肾小球基底膜通透性减轻肾小球高灌注、高滤过降低尿蛋白且可预防肾脏纤维化 本研究结果显示观察组治疗后、均低于对照组、和总有效率均高于对照组 证实补阳还五汤合参芪地黄汤化裁治疗气阴两虚夹瘀型 可取得更为满意的疗效益气养阴兼活血通络可改善机体氧化和抗氧化平衡保护血管内皮功能拮抗氧化应激对肾脏微血管的氧化损伤从而保护肾功能 但中药复方作用机制复杂其具体作用机制尚不明确组方用药剂量可能对研究结果有一定影响这些均有待研究探讨利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 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