湖泊红球藻等离子诱变及其高产虾青素藻株培养条件的优化.pdf
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1、代容春,林荣华,何文锦,等.湖泊红球藻等离子诱变及其高产虾青素藻株培养条件的优化 J.食品工业科技,2023,44(23):213220.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030120DAI Rongchun,LIN Ronghua,HE Wenjin,et al.Plasma Mutagenesis of Haematococcus lacustris and Optimization of CultureConditionsforHigh-yieldAstaxanthinAlgaeStrainsJ.ScienceandTechnologyofFoodIndu
2、stry,2023,44(23):213220.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030120 工艺技术 湖泊红球藻等离子诱变及其高产虾青素湖泊红球藻等离子诱变及其高产虾青素藻株培养条件的优化藻株培养条件的优化代容春1,2,*,林荣华1,2,何文锦1,2,薛婷1,2,陈建楠1,2,陈菁1,2,孙化淼1,2(1.福建师范大学生命科学学院,福建福州350117;2.福建师范大学南方海洋研究院,福建福州350117)摘要:为进一步提高湖泊红球藻(Haematococcuslacustris)的工业利用价值,
3、本研究使用常压室温等离子体(atmosphericandroomtemperatureplasma,ARTP)诱变仪对湖泊红球藻进行等离子诱变。以藻细胞致死率为指标确定等离子诱变的适宜输入功率和诱变时间。诱变之后通过固体平板培养初筛和液体培养复筛获得高产虾青素的突变藻株。再以藻细胞密度为指标采用单因素实验及正交试验对高产藻株的营养生长阶段的培养条件进行优化,并筛选虾青素诱导阶段适宜虾青素积累的高光照条件。在优化的培养条件下多次继代后观察高产突变藻株的遗传稳定性。结果表明,湖泊红球藻等离子诱变的适宜条件是功率 240W、诱变时间 150s 或功率 400W、诱变时间120s。通过初筛和复筛获得生
4、长快、虾青素产量高的突变藻株有 11 株,其中编号为 HP3 的突变藻株生长最快、虾青素产量最高,培养后藻细胞密度和虾青素产量较出发株分别提高了 25.5%和 61.6%。经过两阶段培养条件的优化,HP3 的藻细胞密度和虾青素产量较优化前分别提高了 14.3%和 19.3%,达 7.2105cell/mL 和 31.264mg/L。湖泊红球藻高产突变藻株 HP3 多次继代后藻细胞生长良好,遗传稳定,培养后藻细胞密度和虾青素产量均与初代培养相近。研究结果对湖泊红球藻产虾青素工业藻株的选育具有实际意义。关键词:湖泊红球藻,常压室温等离子体(ARTP),诱变,虾青素,培养条件本文网刊:中图分类号:Q
5、949.2文献标识码:B文章编号:10020306(2023)23021308DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023030120PlasmaMutagenesisofHaematococcuslacustrisandOptimizationofCultureConditionsforHigh-yieldAstaxanthinAlgaeStrainsDAIRongchun1,2,*,LINRonghua1,2,HEWenjin1,2,XUETing1,2,CHENJiannan1,2,CHENJing1,2,SUNHuamiao1,2(1.CollegeofLifeS
6、ciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou350117,China;2.SouthernInstituteofOceanography,FujianNormalUniversity,Fuzhou350117,China)Abstract:To further enhance the industrial utilization value of Haematococcus lacustris,the plasma mutagenesis ofHaematococcus lacustriswascarriedoutbyanatmosphericandroomtem
7、peratureplasma(ARTP)mutagenesisequipment.Theoptimuminputpowerandmutagenesistimeforplasmamutagenesisweredeterminedwithlethalrateofalgalcellsastheindex.Aftermutagenesis,high-yieldastaxanthinmutantalgaestrainswereobtainedthroughprimaryscreeningofsolidplatecultureandsecondaryscreeningofliquidculture.The
8、n,thecultureconditionsofhighyieldalgalplantsatvegetativegrowthstagewereoptimizedbysingle-factorandorthogonalexperimentwithalgaecelldensityastheindex,andthesuitablehighlightconditionsforastaxanthinaccumulationduringastaxanthininductionstagewereselected.Thegeneticstabilityofthehighyieldingmutantalgaes
9、trainswasobservedaftermultiplesubculturesundertheoptimizedcultureconditions.TheresultsshowedthattheoptimumconditionsforplasmamutagenesisofHaematococcus lacustriswere240W收稿日期:20230310基金项目:国家现代农业产业技术体系项目(CARA-170501);福建省团队科技特派员项目(2021386)。作者简介/通信作者*:代容春(1973),女,硕士,副教授,研究方向:微藻培育及分子生物学,E-mail:。第44卷第23期食
10、品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.2023for150sor400Wfor120s.11Mutantalgastrainswithfastgrowthandhighastaxanthinyieldwereobtainedthroughprimaryscreeningandrescreening,whereinthestrainHP3grewfastestandhadthehighestastaxanthinyield.Afterculture,itscelldensityandastaxanthinyie
11、ldwereincreasedby25.5%and61.6%respectivelycomparedwiththeoriginalstrain.Aftertwo-stageoptimization,thecelldensityandastaxanthinyieldofHP3increasedby14.3%and19.3%respectively,reaching7.2105cell/mLand31.264mg/L.HP3showedgoodgrowthandstableheredity.Itscelldensityandastaxanthinyieldweresimilartothoseofp
12、rimaryculture.TheresultshavepracticalsignificanceforthebreedingofindustrialalgalstrainsproducingastaxanthinfromHaematococcus lacustris.Key words:Haematococcus lacustris;atmospheric and room temperature plasma(ARTP);mutagenesis;astaxanthin;cultureconditions虾青素是一种具有超强抗氧化活性的类胡萝卜素含氧衍生物,应用于医药、化妆品、功能性食品、养
13、殖业等多个领域,经济价值高12。天然虾青素主要是从水产品的加工废弃物、细菌和真菌及藻类中获得。水产品的加工废弃物中虾青素含量比较低,且因为提取过程较为复杂导致提取的成本较高,因此不宜作为大规模提取天然虾青素的原料3。细菌和真菌虽然繁殖速度快、培养成本低,但是菌体虾青素含量很低,并不适合作为虾青素的制备原料3。综合考虑,藻类被认为是提取天然虾青素最佳的原材料。其中湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)是公认的生产天然虾青素的理想来源,是高价值的工业微藻46。湖泊红球藻是淡水单细胞绿藻,目前主要采用两步法诱导藻细胞积累虾青素,首先,营养生长阶段最大限度地获取生物量,藻体为绿色
14、;其次,虾青素诱导阶段通过逆境条件诱导虾青素的大量积累,藻体逐渐转为红色。当前培养周期长、虾青素产量不高及藻种退化等问题直接影响湖泊红球藻的工业生产应用78。因此,选育优良的湖泊红球藻藻株、筛选湖泊红球藻最适宜的培养条件具有重要意义。近年来,许多研究者在提高湖泊红球藻的生长性能和虾青素产量方面进行了探索并取得了一定的成果。如 Khorshidi 等9利用静磁场(SMF)促进了湖泊红球藻的生长和虾青素产量的提高。Lee 等10通过引入“红细胞”接种体系(RCIS)并在培养基中添加 FeSO4、NaCl 和 NaHCO3等成分有效缩短了湖泊红球藻的培养周期。Zhu 等11用纳米气泡水(NBW)代替
15、培养基中的蒸馏水使湖泊红球藻的生物量提高了 44%。但迄今为止国内外对湖泊红球藻的相关研究主要集中在促进藻株生长及虾青素积累的培养条件方面913,藻种改良上仅见 LE-FEUVRE 等采用秋水仙碱对湖泊红球藻进行多倍体育种使虾青素产量提高了 33%14。诱变育种是一种重要的育种方法,但在湖泊红球藻中的应用尚未见报道。因此,利用诱变育种技术改良现有湖泊红球藻藻种,选育优良的高产突变藻株势在必行。常压室温等离子体(atmosphericandroomtem-peratureplasma,ARTP)诱变是一种新型的诱变育种手段,具有高效、突变速度快、环境友好等特点15;与其它物理诱变方法相比,ART
16、P 具有放电均匀、活性粒子浓度高、操作简单、安全性好等优点16。因此,ARTP 已广泛应用于微生物、微藻、植物种子等材料,并取得良好的诱变效果。如采用 ARTP 诱变褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)使固氮酶活性提高了 101.72%15,ARTP 诱变裂殖壶菌(Schizo-chytrium limacinum)使二十二碳六烯酸(DHA)产量提高了 46.12%16;小新月菱形藻(Nitzschia closter-ium f.minutissima)和 湛 江 等 鞭 金 藻(Isochrysiszhangjiangensis)经 ARTP 诱变后藻株生长速度和目
17、标产物产量均有明显的提高1718;ARTP 辐照还促进了两色金鸡菊(Coreopsis tinctoriaNutt.)种子的萌发和幼苗的生长19,促进了玉米(Zea maysL.)幼苗的生长20。本研究利用常压室温等离子体诱变仪对湖泊红球藻进行诱变,筛选生长快、虾青素产量高的突变藻株。诱变之后采用单因素实验及正交试验,优化湖泊红球藻高产藻株生长的光照强度、培养温度、培养基等培养条件,并进一步筛选积累虾青素的适宜高光照条件。高产藻株多次继代后,通过测定其营养生长阶段的藻细胞密度以及虾青素诱导阶段的虾青素产量,来观察高产突变藻株的表型和遗传稳定性。实验采用等离子诱变结合培养条件的优化使湖泊红球藻能
18、更高效地增加生物量和积累虾青素,结果对选育湖泊红球藻产虾青素工业藻株具有现实意义,对其他藻类的育种具有一定的参考价值。1材料与方法1.1材料与仪器湖泊红球藻(Haematococcus lacustris)藻种 H5武汉水生所,培养条件:BBM 培养基21、温度20、光照强度 2000lx、光暗比 12h:12h;培养基各组成成分药品分析纯,国药集团化学试剂有限公司;PCR 体系反应物、DNAMarkerTaKaRa 公司;鲁哥氏碘液生工生物工程(上海)股份有限公司;虾青素标准品、二氯甲烷色谱级,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇色谱级,德国默克公司。ARTP-S 常压室温等离子体诱变仪无锡
19、源清天木生物科技有限公司;5424R 高速离心机德国艾本德股份有限公司;lifeECOPCR 仪GeneCompanyLimited;SMART 光学显微镜重庆奥特光学仪器有限责任公司;JXFSTPRP-64 全自动样品快速研磨仪上海净信实业发展有限公司;LJG-214食品工业科技2023 年12月12 真空冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司;2695 高效液相色谱沃特世科技上海有限公司。1.2实验方法1.2.1藻种的鉴定藻种无菌纯化后扩大培养,取适量藻液,8000r/min 离心 5min 后收集藻泥,CTAB法22提取藻细胞 DNA,利用通用引物 TGF、TGR(由生工生物公司合成)扩
20、增 18SrDNA,PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化,阳性条带切胶回收后送生工生物公司进行基因测序。使用 NCBI 对 18SrDNA 基因序列进行比对分析。1.2.2等离子诱变参考潘艳飞22的实验方法。对数生长期的湖泊红球藻稀释 100 倍后取 200L 于载玻片上,均匀涂开,使用 ARTP 诱变仪进行诱变。照射距离 2mm,气体流速 10L/min,输入功率:240W或 400W,照射时间:30、60、90、120、150、180、210s7 个梯度,以照射时间 0s 为对照。诱变完成后,将载玻片上的藻液全部转移至离心管中,并用 200L 培养基冲洗载玻片,一并转入离心管,黑暗静置 3h
21、后取 200L 藻液均匀涂布到固体平板上。每个处理重复 3 次。固体平板培养条件:BBM 琼脂培养基、光照强度 2000lx、培养温度 20。21d 后统计不同功率、不同诱变时间下的单藻落数量,计算致死率。致死率(%)=各处理单藻落数量/对照单藻落数量100。确定致死率为 90%左右的输入功率和照射时间,重新多次进行诱变实验。1.2.3高产藻株的筛选突变株的初筛,待固体培养基上长出单藻落,将平板移至 8000lx 的高光照下进行培养,培养温度 20,一定时间后挑选体积较大且颜色较红的单藻落培养于 24 孔板,待藻细胞繁殖较多时进行扩大培养。突变株的复筛,将通过初筛获得的藻株扩大培养至对数期,在
22、光学显微镜下进行藻细胞准确计数,5000r/min 离心 5min 收集藻细胞,以 1.2105cell/mL的起始藻细胞密度进行生长培养,培养条件:BBM 培养基、光照强度 2000lx、温度 20,每天摇瓶 2 次,培养 14d 后,再次进行藻细胞准确计数。计数方法:取藻液 1mL,加入鲁哥氏碘液 10L 固定藻细胞,使用血球计数板进行计数,每个样品计数 5 次,取平均值。筛选生长快速的藻株。将这些藻株的藻液转移至胁迫培养条件(光照强度 8000lx)下继续培养,培养温度 20,21d 后取样测定虾青素含量,计算藻株的虾青素产量。未经诱变的野生型藻株作为对照,选择生长快、虾青素产量高的突变
23、株作为高产藻株进行后续的实验。虾青素含量的测定方法:参考国标 GB/T31520-2015 红球藻中虾青素的测定,采用高效液相色谱法23。色谱柱为 SunFireC182504.6/5m(186002560),色谱条件:检测器为 PDA,流动相为甲醇:去离子水=95:5,流速 1mL/min,检测波长 474nm,进样量20L,柱温 25。用虾青素标准品制作标准曲线,得线性回归方程为 y=200815x+1036(R2=0.9992),线性范围 120g/mL,通过标准曲线计算湖泊红球藻的虾青素含量。1.2.4高产藻株培养条件的优化1.2.4.1高产藻株营养生长阶段培养条件的优化以藻细胞密度为
24、指标对影响湖泊红球藻生长的因子光照强度、培养温度、培养基进行单因素实验。在温度 20 和 BBM 培养基的条件下,分别以 1000、1500、2000、2500、3000lx 为光照强度,确定湖泊红球藻生长的适宜光照强度;在光照强度 2000lx 和BBM 培养基的条件下,分别以 15、20、25、30、35为培养温度,确定湖泊红球藻生长的适宜培养温度;在光照强度 2000lx 和温度 20 的条件下,分别以MCM21、BBM、BG1121、TAP24、HS24为培养基,确定湖泊红球藻生长的适宜培养基。采用 L9(34)正交试验,依据单因素实验结果分别设计因素光照强度、培养温度、培养基的水平值
25、(见表 1),筛选湖泊红球藻高产藻株营养生长阶段的最适培养条件。表1正交试验因素水平表Table1Tableoforthogonalexperimentalfactorlevels水平因素A光照强度(lx)B培养温度()C培养基1150020MCM2200025BBM3250030BG11按上述实验配制新鲜培养基于锥形瓶中,每瓶100mL,各 3 瓶。取预培养(培养条件同复筛实验)至对数期的高产藻株藻液,5000r/min 离心 5min 收集藻细胞,加入培养基中,使藻细胞培养起始密度为1.2105cell/mL,按单因素实验和正交试验的培养条件进行静置培养,每天摇瓶 2 次,培养 14d 后
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