化学发光磁酶免疫分析法检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌.pdf
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1、144食品安全与检测2.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室,河南郑州450 0 0 1;3.桃城区动物防疫站,河北衡水0 530 0 0)摘要:建立化学发光磁酶免疫分析法检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌,并优化化学发光条件和免疫反应条件。结果表明:最佳发光条件为鲁米诺、过氧化氢、对碘苯酚的浓度分别为5.0 10-3、1.7610-2、5.0 10-3mo l/L,辣根过氧化物酶的质量浓度为5.0 10-5mg/mL;最佳免疫条件为免疫磁珠用量50 L、一抗体积稀释比1:8 0 0 0;方法的检出限为3.0 10 3CFU/mL,回收率为87.94%113.04%。建立的方法可用于牛奶中鼠伤寒沙门氏菌
2、的检测。关键词:化学发光磁酶免疫分析法;鼠伤寒沙门氏菌;牛奶Detection of Salmonella typhimurium in milk bychemiluminescence magnetic enzyme immunoassay methodJIE Ming-sha?2,LAN Sheng-kai,WAN Jia-yun,LI Xin-yan(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,2.Henan Key Laboratory of Cold Chain Food Qu
3、ality and Safety Control,3.Animal Epidemic Prevention Station of Taocheng District,Hengshui 053000,Hebei,China)Abstract:A chemiluminescence magnetic enzyme immunoassay method was established for the detectionof Salmonella typhimurium in milk,and the chemiluminescence and immune reaction conditions w
4、ere opti-mized.The results showed that the optimal chemiluminescence conditions were as follows:the concentra-tions of luminol,hydrogen peroxide,and p-iodophenol were 5.0 10-3,1.76 10-2,5.0 10-3 mol/Lrespectively,and the mass concentration of horseradish peroxidase was 5.0 x10-5 mg/mL.The optimalimm
5、une reaction conditions were dosage of immunomagnetic beads was 50 L and dilution volume ratio ofprimary antibody was 1:8 000.The detection limit of the method was 3.0 x103 CFU/mL,with a recov-ery rate of 87.94%-113.04%.The established method can be used for the detection of Salmonella ty-phimurium
6、in milk.Key words:chemiluminescence magnetic enzyme immunoassay method;Salmonella typhimurium;milk中图分类号:TS252.7鼠伤寒沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,能够引起胃肠炎、败血症和伤寒等感染性疾病,其传播途径主要为动物源性食品,如肉、蛋、奶、水产品等 1-3。化学发光免疫分析是继放射免疫分析、收稿日期:2 0 2 2-11-0 7基金项目:河南省科技攻关项目(2 32 10 2 1110 7 1、2 0 2 10 2 110 140)作者简介:介明沙(19 8 6 一),女,博士,讲师,研
7、究方向为食品安全质量检测。粮食与油脂化学发光磁酶免疫分析法检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌介明沙12,蓝晟恺,万嘉芸,李新燕”(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州450 0 0 1;Zhengzhou 450001,Henan,China;Zhengzhou 450001,Henan,China;文献标志码:A2023年第36 卷第11期文章编号:10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)11-0 144-0 5酶免疫分析和荧光免疫分析之后发展起来的新型免疫检测技术 4-5。化学发光免疫分析具有无散射光干扰、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短等优点,广泛应用于食品安全检测领域,尤其是对食源
8、2023年第36 卷第11期性致病菌的检测 6-8 。在化学发光免疫分析中引人经抗体或适配体修饰的超顺磁性纳米颗粒,有助于快速捕获目标物,同时起到分离富集和信号放大的作用,进而缩短检测时间、提高检测灵敏度。目前,基于免疫磁纳米颗粒的化学发光磁酶免疫分析(CLME-IA)已应用于不同食品污染物的检测中 9-1本研究以鼠伤寒沙门氏菌为待测目标物,采用免疫磁分离技术分离富集目标物,通过优化化学发光底物体系和免疫反应条件,建立CLMEIA法快速检测牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的方法,以期为牛奶中鼠伤寒沙门氏菌污染探索快速灵敏的检测方法提供参考。1材料与方法1.1 材料与试剂鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)
9、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、单核增生李斯特菌(ATCC15313)、大肠杆菌0 157:H7(A T CC438 9 5),广东省微生物菌种保藏中心;鼠伤寒沙门氏菌单抗、生物素标记沙门氏菌多抗,美国Abcam公司;辣根过氧化物酶(HRP,30 0 U/m g)、磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.01mol/L,p H 7.4),北京索莱宝科技有限公司;HRP标记的羊抗小鼠IgG,北京博奥森生物技术有限公司;链霉亲和素磁珠(2.8 m,10 mg/mL),无锡百迈格生物科技有限公司;鲁米诺(luminol,质量分数97%),美国Sigma-Aldrich公司;对碘苯酚(PIP,质量分数9 8%
10、)、质量分数30%H,02、吐温2 0,国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白陈大豆肉汤,青岛海博生物技术有限公司;纯牛奶,市售;磷酸盐洗液(PBS T,含体积分数0.0 5%吐温2 0 的PBS溶液),实验室自制。1.2仪器与设备Spark20M型多功能微孔板读数仪,瑞士Tecan有限公司;BJ-2CD型超净工作台,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SHP-250型恒温培养箱,上海鸿都电子科技有限公司;ME204/02型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;T6型新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1菌种的复苏将盛有鼠伤寒沙门氏菌菌种冻干粉的容器置于超净
11、工作台上,向其中加入50 0 L灭菌后的新鲜胰蛋白陈大豆肉汤,用移液枪吹打混匀后,采用接种环取适量冻干粉悬液,接种到液体培养基中,于粮食与油脂37恒温摇床中培养2 4h后取出,观察培养基表面是否有其他杂菌,确保无其他杂菌后方可进行后续试验。1.3.2免疫磁珠的制备取7.6 mL0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)于离心管中,向其中加入40 0 L链霉亲和素磁珠,混合均匀后加人40 0 L已10 倍体积稀释的生物素标记沙门氏菌多抗,在37 恒温摇床中孵育 3 h后,置于4冰箱中备用。1.3.3鼠伤寒沙门氏菌的测定(1)将免疫磁珠按50 L/孔的量,加入到9 6 孔板中,放置于磁分离板上分
12、离3min,弃上清液,向其中添加特定稀释度的菌液(10 0 L/孔),盖上盖子,在37 恒温培养箱中孵育 6 0 min。(2)利用磁性分离板将免疫磁珠与菌体复合物磁分离后,弃上清液,向其中加人30 0 L/孔的0.01mol/LPBST洗液(含体积分数0.0 5%吐温20的PBS溶液)充分振荡,洗板2 次。向9 6 孔板中加入10 0 L鼠伤寒沙门氏菌单抗(一抗)体积稀释液(鼠伤寒沙门氏菌单抗与PBST按体积比1:10000稀释),于37 恒温培养箱中孵育6 0 min。(3)孵育结束后,用磁分离板将免疫磁珠-菌体-一抗复合物磁分离3min后,弃上清液,用PBST溶液洗板2 次。向孔板中加人
13、10 0 LHRP标记的羊抗小鼠IgG稀释液(HRP标记单抗小鼠IgG与PBST按体积比1:10 0 0 0 稀释),于37 恒温培养箱中孵育6 0 min后,磁分离3min,弃上清液,用PBST溶液洗板4次。(4)每孔分别加人化学发光底物A(最佳lumi-nol浓度和最佳PIP浓度的混合溶液)、B(H,O 溶液)各10 0 L,避光反应后检测各孔的化学发光情况,平行测定3次,记录其相对光单位(RLU)。1.3.4化学发光底物单因素试验化学发光底物体系单因素试验的基础条件为5.010=3mol/Lluminol 溶液、1.7 6 10-mol/LH,0,溶液、5.0 10-5mg/mLHRP溶
14、液、5.0 10-3mol/L PIP 溶液;考察范围分别为 5.0 10-7 1.0 10-2 mol/L8.8 10-4 7.06 10-mol/L、1.0 10-6 1.0 10-4 mg/mL、5.0 10 -7 1.0 10-2 mol/L;依次研究luminol 浓度、H,O,浓度、HRP质量浓度、PIP浓度对化学发光底物体系发光强度(以RLU表示)的影响。得出每个单因素的最优条件,带人下一组条件优化试验,最终优化出最佳底145146物反应条件组合。1.3.5免疫反应条件优化试验分别采用2 5、50、7 5、10 0、150、2 0 0 L免疫磁珠捕获鼠伤寒沙门氏菌,在最佳化学发光
15、底物条件下进行上机检测优化最适免疫磁珠用量。将CLMEIA检测体系中的一抗与PBST按体积比1:2 0 0 0、1:4000、1:6 0 0 0、1:8 0 0 0 稀释进行优化试验。1.3.6牛奶样品检测取纯牛奶1mL,以12 0 0 0 r/min离心5min,弃上清液,除去牛奶中的脂肪,向其中加人1mL0.01 mol/LPBS缓冲溶液,涡旋混匀后以12000r/min离心2 min,弃上清液,重复2 次,再向其中加人1 mL 0.01 mol/L PBS缓冲溶液后,以12000r/min离心5min,取上清液1mL,用超纯水稀释至10 mL作为牛奶样液。将1mL2.5310、5.061
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