基于NF-κB信号通路探讨益气活血托毒方对自身免疫性前列腺炎小鼠的影响.pdf
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1、中国中医药信息杂志2023 年 8 月第 30 卷第 8 期基于NF-B信号通路探讨益气活血托毒方对自身免疫性前列腺炎小鼠的影响张泽家,杨小琴,高庆和,陈豪特,丁家森,刘剑刚,高瞻中国中医科学院西苑医院,北京 100091摘要:目的基于核转录因子-B(NF-B)信号通路探讨益气活血托毒方对自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠的影响及作用机制。方法50只C57BL/6小鼠采用前列腺蛋白提纯液联合弗氏完全佐剂制备EAP小鼠模型,将造模成功的40只小鼠随机分为模型组、西药组(坦索罗辛)和中药(益气活血托毒方)低、高剂量组,每组10只,另取10只小鼠作为空白组,各给药组分别予相应药物灌胃,连续4周。观察小
2、鼠一般状况,ELISA检测血清炎症因子及免疫球蛋白含量,HE染色观察前列腺组织病理变化,Western blot检测前列腺组织p-NF-B p65、p-NF-B抑制物激酶(p-IKK-)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量减少(P0.01),血清TNF-、IL-1、IgA、IgG、IgM含量升高(P0.01,P0.05),前列腺组织炎症反应明显,p-NF-B p65、p-IKK-、TNF-、IL-1蛋白表达升高(P0.01,P0.05);与模型组比较,中药低、高剂量组和西药组小鼠体质量增加(P0.05,P0.01),中药高剂量组小
3、鼠血清TNF-、IL-1、IgA、IgG、IgM含量明显降低(P0.05,P0.01),前列腺组织炎症反应明显减轻,p-NF-B p65、p-IKK-、TNF-、IL-1蛋白表达降低(P0.01,P0.05)。结论益气活血托毒方可有效改善EAP小鼠前列腺组织病理形态,减轻炎症反应,调节免疫功能,其作用机制可能与抑制NF-B信号通路相关蛋白p-NF-B p65、p-IKK-、TNF-、IL-1表达相关。关键词:益气活血托毒方;自身免疫性前列腺炎;NF-B信号通路;炎症;免疫;作用机制;小鼠中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2023)08-0075-06DOI
4、:10.19879/ki.1005-5304.202209023开放科学(资源服务)标识码(OSID):Effects of Yiqi Huoxue Tuodu Prescription on Experimental Autoimmune Prostatitis Mice Based on NF-B Signaling PathwayZHANG Zejia,YANG Xiaoqin,GAO Qinghe,CHEN Haote,DING Jiasen,LIU Jiangang,GAO ZhanXiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical
5、 Sciences,Beijing 100091,ChinaAbstract:Objective To explore the effects and mechanism of Yiqi Huoxue Tuodu Prescription on experimental autoimmune prostatitis(EAP)mice based on nuclear factor(NF)-B signaling pathway.Methods Totally 50 C57BL/6 mice were treated with purified prostatic protein solutio
6、n combined with Freunds complete adjuvant to make EAP mouse model.The 40 mice were randomly divided into model group,Western medicine group(tamsulosin)and TCM(Yiqi Huoxue Tuodu Prescription)low-and high-dosage groups,with 10 mice in each group.Another 10 mice were selected as blank group.Each admini
7、stration group was given corresponding drug for gavage for 4 weeks.The general condition was observed,the contents of inflammatory factors and immunoglobulin in serum were detected by ELISA,the pathological changes of prostate tissue were observed by HE staining,the expressions of p-NF-B p65,p-IKK-,
8、TNF-and IL-1 protein in prostate tissue were detected by Western blot.Results Compared with the blank group,the body mass of the mice in model group decreased(P0.01),the serum contents of TNF-,IL-1,基金项目:国家自然科学基金青年基金(82104880);中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目(CI2021A02205)通讯作者:高瞻,E-mail:实验研究75Aug.2023 Vol.30 No.8
9、 Chinese Journal of Information on TCMIgA,IgG and IgM increased(P0.01,P0.05),and the inflammatory reaction of prostate tissue was obvious,the protein expressions of p-NF-B p65,p-IKK-,TNF-and IL-1 increased(P0.01,P0.05).Compared with the model group,the body mass of the mice in TCM low-and high-dosag
10、e groups and Western medicine group increased(P0.05,P0.01),the contents of TNF-,IL-1,IgA,IgG and IgM in serum of mice in TCM high-dosage group significantly decreased(P0.05,P0.01),the inflammatory reaction of prostate tissue was significantly reduced,and the protein expressions of p-NF-B p65,p-IKK-,
11、TNF-and IL-1 decreased(P0.01,P0.05).Conclusion Yiqi Huoxue Tuodu Prescription can effectively improve the pathological morphology of prostate tissue in EAP mice,reduce inflammation and regulate immune function.Its mechanism may be related to the inhibition of the expression of NF-B signaling pathway
12、 related proteins of p-NF-B p65,p-IKK-,TNF-and IL-1.Keywords:Yiqi Huoxue Tuodu Prescription;experimental autoimmune prostatitis;NF-B signaling pathway;inflammation;immunity;mechanism;mice型前列腺炎是一种以长期、反复骨盆区域疼痛不适,可伴有不同程度排尿症状及性功能障碍为主要临床表现的疾病,严重影响患者生活质量1。研究显示,免疫因素在型前列腺炎的发生发展过程中发挥重要作用2。中国中医科学院西苑医院高瞻教授基于“内
13、痈”理论及临床经验拟定的益气活血托毒方能显著缓解型前列腺炎患者临床症状,降低慢性前列腺炎症状评分,减少患者前列腺液中炎症因子表达3,但其作用机制尚未完全明确。课题组前期研究发现,益气活血托毒方与型前列腺炎的交集靶点主要富集在核转录因子-B(NF-B)通路上,故预测益气活血托毒方可能通过降低前列腺组织炎症因子水平,阻止其下游NF-B抑制物激酶(IKKs)磷酸化及NF-B抑制蛋白(IB)与NF-B二聚体解离,从而抑制NF-B进入细胞核内催化炎症因子产生和激活免疫反应。目前认为,型前列腺炎发病与自身免疫关系密切,自身 免 疫 性 前 列 腺 炎(experimental autoimmune pro
14、statitis,EAP)小鼠模型是研究型前列腺炎的标准动物模型之一4。基于此,本研究应用前列腺蛋白提纯液联合弗氏完全佐剂建立EAP小鼠模型,观察益气活血托毒方对EAP小鼠前列腺组织病理变化、炎症反应及免疫功能等方面的影响,探讨其治疗型前列腺炎的作用机制。1材料与方法材料与方法1.1动物SPF级8周龄C57BL/6雄性小鼠60只,体质量(232)g,8周龄雄性SD大鼠10只,体质量(18020)g,斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,动物生产许可证号 SCXK(京)2019-0030,合格证号110324211104281256。饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房,温度(242)、湿度
15、50%70%环境,动物使用许可证号SYXK(京)2018-0018。本实验经中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批(2021XLC043-2)。1.2药物及制备益气活血托毒方由黄芪30 g、党参15 g、丹参15 g、川芎10 g、白术10 g、茯苓10 g、熟大黄6 g组成,由中国中医科学院西苑医院制剂室制成浸膏,每克浸膏含原药材2.5 g。盐酸坦索罗辛缓释胶囊,0.2 mg/粒,江苏恒瑞医药股份有限公司,临用前取胶囊内容物,用蒸馏水配制成0.65 g/mL溶液。1.3主要试剂与仪器弗氏完全佐剂(美国Sigma,批号SLCB9716),0.5%Triton X-100(上海碧云天生物技术有限公
16、司,批号120320210616),BCA蛋白试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号122120210520),小鼠免疫球蛋白IgG/A/M试剂盒(北京华英生物技术研究所,批号20220105BH),血清肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)试剂盒(北京欣博盛生物,批号分别为20220105X、20220106X),p-NF-B p65、IL-1抗体(英国 Abcam 公司,批号分别为 ab86299、ab283818),p-IKK-、TNF-抗体(美国GeneTex公司,批号分别为GTX52310、GTX110520)。MultiSkan3 型 酶 标 仪,美 国 Ther
17、mo 公 司;EG1150型病理包埋机,德国Leica公司;7160型全自动生化仪,日本Hitachi公司;DR-200BS型全自动酶标分析仪,无锡华卫德朗仪器有限公司;Mini P-4型电泳槽、湿转电泳槽,北京凯元信瑞仪器有限公司;PowerPac型电泳仪,美国Bio-Rad公司。1.4前列腺蛋白提纯液制备取10只大鼠,常规饲养7 d,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,取前列腺,放入冰生理盐水中,去除脂肪、膀胱等组织,清洗35次,剪碎,加入含0.5%Triton X-100的生理盐水,冰浴匀浆,4、15 000 r/min离心76中国中医药信息杂志2023 年 8 月第 30 卷第 8 期30
18、min4,去除上层脂肪组织,取上清液,即得前列腺蛋白提纯液,放入冻存管,-20 保存备用。临用前用BCA法测定蛋白浓度,根据蛋白浓度用0.01 mmol/L PBS将蛋白提纯液稀释至15 mg/mL。1.5造模取50只小鼠,肌肉注射氯胺酮(46 mg/kg)麻醉,在小鼠双侧脚掌、双侧腹股沟及颈部共5处皮下注射0.1 mL前列腺蛋白提纯液与0.1 mL弗氏完全佐剂的混合液4-5。造模0、15、30 d各注射1次。造模15、22、30 d各随机选取2只小鼠,取前列腺组织进行病理检测,观察炎症进展情况。造模45 d随机选取4只小鼠,取前列腺组织进行病理检测,若见黏膜皱襞消失,腺上皮破坏,间质明显肿胀
19、、模糊,有大量炎症细胞浸润,表明模型制备成功4。1.6分组及给药将造模成功的40只小鼠随机分为模型组、西药组和中药低、高剂量组,每组10只。另取10只小鼠作为空白组。造模成功次日开始给药,中药低剂量组按人与小鼠等效剂量换算6,益气活血托毒方浸膏4.8 g/kg,高剂量组剂为9.6 g/kg,西药组予0.65 g/mL盐酸坦索罗辛溶液灌胃,灌胃体积0.4 mL/只,模型组和空白组予等体积饮用水灌胃,每日1次,连续4周。1.7指标检测1.7.1小鼠一般状况造模及给药期间,观察小鼠生活状态及体征,造模期间每15 d记录1次体质量,给药期间每2周记录1次体质量。1.7.2血清炎症因子和免疫因子检测给药
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