干细胞研究进展-2010讲稿-0.ppt

干细胞研究进展干细胞研究进展组胚：郭雨霁第一页，共四十五页。1981年年Evans等成功地建立了小鼠的等成功地建立了小鼠的ESC系；系；1995年年Thompson等建立了第一株灵长类动物的等建立了第一株灵长类动物的ESC系；系；1998年年11月，美国威斯康星大学的科学家在美国科学杂志报告说，他们已成功月，美国威斯康星大学的科学家在美国科学杂志报告说，他们已成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖；地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖；1999年年12月，干细胞研究进展被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首月，干细胞研究进展被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首;1999年年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体(chn t)干细胞可以干细胞可以“横向分化横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体体(chn t)干细胞，包括人类的成体干细胞，包括人类的成体(chn t)干细胞具有可塑性干细胞具有可塑性;2001年末年末,干细胞研究又被其列为六大热门科技领域之首干细胞研究又被其列为六大热门科技领域之首;干细胞的话题沸沸扬扬干细胞的话题沸沸扬扬(fi fi yng yng)(fi fi yng yng)地充斥在全球各地充斥在全球各种新闻媒体种新闻媒体第二页，共四十五页。2001年年4月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。2006年两项研究成果标志着干细胞技术正从一种概念，转变成能够看得见的事实：年两项研究成果标志着干细胞技术正从一种概念，转变成能够看得见的事实：美国科学家利用胚胎干细胞所衍生的运动神经元让瘫痪的老鼠恢复美国科学家利用胚胎干细胞所衍生的运动神经元让瘫痪的老鼠恢复(huf)了行走能力；了行走能力；英国科学家从胚胎干细胞中培育出来的精子，并使之与卵细胞结合，生育出幼鼠。英国科学家从胚胎干细胞中培育出来的精子，并使之与卵细胞结合，生育出幼鼠。2010年年1月韩国朝鲜日报报道，韩国建国大学兽医学院教授利用人类脐带血干细胞成功月韩国朝鲜日报报道，韩国建国大学兽医学院教授利用人类脐带血干细胞成功治愈了脊髓受伤导致两条后腿瘫痪的狗。治愈了脊髓受伤导致两条后腿瘫痪的狗。分离和体外培养各种来源的干细胞的技术不断成熟分离和体外培养各种来源的干细胞的技术不断成熟,更是引发了新一轮的干细胞研究热潮。更是引发了新一轮的干细胞研究热潮。美美国国加加州州每每年年提提供供干干细细胞胞研研究究经经费费达达3亿亿美美元元。我我国国的的干干细细胞胞研研究究也也很很活活跃跃，“863”计计划划近近期期将将为为干干细细胞胞研研究究提提供供2亿亿元元人人民民币币的的经经费费。2000年年日日本本启启动动“千千年年世世纪纪工工程程”，干干细细胞胞工工程程为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达108亿日元。亿日元。第三页，共四十五页。到底干细胞是什么东西，为何会受到如此的关注？到底干细胞是什么东西，为何会受到如此的关注？干细胞是潜力无穷？还是被我们干细胞是潜力无穷？还是被我们(w men)过度期待？过度期待？干细胞干细胞（stem cells）是一类能够进行自我更新是一类能够进行自我更新(gngxn)（self-renew）和尚未分化和尚未分化 （un-differentiated具有分化潜能具有分化潜能）的细胞的细胞；可以分化为多种组成人体的组织或器官的细胞类型可以分化为多种组成人体的组织或器官的细胞类型。第四页，共四十五页。自然存在自然存在(cnzi)的各种干细的各种干细胞胞多能多能(du nn)(pluripotent)干细干细胞胞(胚胎干细胞、胚胎生殖细胞胚胎干细胞、胚胎生殖细胞)单能单能(unipotent)干细胞干细胞(成体干细胞成体干细胞)造血造血(zo xu)干细胞干细胞其他组织特异性干细胞其他组织特异性干细胞（神经、肺部干细胞等）（神经、肺部干细胞等）特化细胞特化细胞红细胞红细胞 血小板血小板 白细胞白细胞全能全能(totipotent)干细胞干细胞(受精卵受精卵)第五页，共四十五页。The fertilized ovum is the origin of the life.第六页，共四十五页。滋养层滋养层胎盘及胎儿胎盘及胎儿的附属结构的附属结构第七页，共四十五页。卵黄囊尾侧壁上的内胚层细胞是原始卵黄囊尾侧壁上的内胚层细胞是原始(yunsh)生殖细胞的发源地。生殖细胞的发源地。后经肠系膜迁移至生殖腺嵴。后经肠系膜迁移至生殖腺嵴。第八页，共四十五页。多能干细胞多能干细胞pluripotent stem cells：a、来源：胚胎干细胞来源：胚胎干细胞内细胞群细胞内细胞群细胞 胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞原始生殖细胞原始生殖细胞 b、特点：可进行克隆性增殖而不发生分化，保持二特点：可进行克隆性增殖而不发生分化，保持二 倍体核型不变；倍体核型不变；具有多向分化的潜能，在特定条件下可诱具有多向分化的潜能，在特定条件下可诱 导分化为三个导分化为三个 胚层来源的所有组织细胞；胚层来源的所有组织细胞；失去了发育形成生物个体失去了发育形成生物个体(gt)的能力。的能力。c、多分化潜能性的实验证据：嵌合体实验多分化潜能性的实验证据：嵌合体实验 畸胎瘤实验畸胎瘤实验 类胚体实验类胚体实验第九页，共四十五页。单能干细胞单能干细胞unipotent stem cells：成体干细胞成体干细胞/组织特异性干细胞组织特异性干细胞 a、特征：能自我复制特征：能自我复制,有分化潜能有分化潜能,但只能分化为所在但只能分化为所在 组织的功能组织的功能(gngnng)细胞。细胞。b、存在部位：骨髓存在部位：骨髓,周围血液周围血液,脑脑,脊髓脊髓,血管血管,骨骼肌骨骼肌,表皮表皮,消化管消化管,角膜角膜,视网膜视网膜,肝肝,胰等胰等 c、可塑性：横向分化可塑性：横向分化 特化细胞特化细胞specialized cells：具有特定形态结构、分子标记和功能，不能进行分化。具有特定形态结构、分子标记和功能，不能进行分化。横向横向(hn xin)分化：分化：通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。部分干细胞在特定条件下可以转化为其它胚层来源的细胞，如肌肉干部分干细胞在特定条件下可以转化为其它胚层来源的细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞等。细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞等。1999年年Goodell等人分离出小鼠的肌肉等人分离出小鼠的肌肉(jru)干细胞，体外培养干细胞，体外培养5天后，与少天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉(jru)干细胞会分化为各种血细胞。干细胞会分化为各种血细胞。第十页，共四十五页。ESC和成体和成体(chn t)干细胞的异同干细胞的异同相同点：都具有干细胞的自我复制和分化能力相同点：都具有干细胞的自我复制和分化能力(nngl)，都有，都有“归巢归巢”现象。现象。第十一页，共四十五页。干细胞是一类能够进行干细胞是一类能够进行自我更新自我更新和和具有分化潜能具有分化潜能的细胞的细胞 （具有分裂增殖能力，干细胞本身不是处于分化途径的终（具有分裂增殖能力，干细胞本身不是处于分化途径的终 端）。端）。干细胞通过两种方式生长干细胞通过两种方式生长 *对称分裂对称分裂-形成两个相同的干细胞形成两个相同的干细胞 *不对称分裂不对称分裂-由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端(zhn dun)成为成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。作为干细胞保留下来。干细胞的共同干细胞的共同(gngtng)特征特征干细胞增殖干细胞增殖(zngzh)的缓慢性的缓慢性干细胞增殖的自稳性干细胞增殖的自稳性区别于肿瘤细胞的本质性特征。区别于肿瘤细胞的本质性特征。有利于其对特定的外界信号有利于其对特定的外界信号做出反应，以决定是进入增做出反应，以决定是进入增殖还是进入分化程序，同时殖还是进入分化程序，同时有利于减少干细胞内基因突有利于减少干细胞内基因突变的危险。变的危险。第十二页，共四十五页。研究干细胞增殖和分化机制的最终研究干细胞增殖和分化机制的最终(zu zhn)目的是应用目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于许多疾病的干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于许多疾病的治疗，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。治疗，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。干细胞的应用干细胞的应用(yngyng)第十三页，共四十五页。胚胎干细胞胚胎干细胞embryonic stem cells 干细胞相关技术干细胞相关技术(jsh)：克隆：克隆clone 转基因技术转基因技术transgenic technology成体干细胞：神经干细胞成体干细胞：神经干细胞neural stem cells 肺干细胞肺干细胞pulmonary stem cells 诱导型多能干细胞诱导型多能干细胞induced pluripotent stem cell主主 要要 内内 容容第2周第3周第十四页，共四十五页。胚胚胎胎干干细细胞胞（embryonic stem cell,ESC）是是从从早早期期胚胚胎胎的的 内内细细胞胞团团中分离出来的一种高度未分化、具有多向分化潜能的细胞。中分离出来的一种高度未分化、具有多向分化潜能的细胞。1981年年Evans等等从从囊囊胚胚的的内内细细胞胞群群中中成成功功分分离离、建建立立(jinl)了了小小鼠鼠的的ESC系系1998年年Thomson和和Gearhart分分别别用用胚胚泡泡内内细细胞胞团团细细胞胞和和原原始始生生殖殖细细胞胞成成功地建立了人的功地建立了人的ESC系系 在全球范围内掀起了在全球范围内掀起了ESC的研究热潮。的研究热潮。胚胎胚胎(piti)干细胞干细胞 ESC的体外培养的体外培养(piyng)建建系系 定向诱导分化定向诱导分化 在生物医学上的应用在生物医学上的应用第十五页，共四十五页。早期小鼠胚胎的获得早期小鼠胚胎的获得(hud)：受精后第受精后第4天上午，取出孕子宫，将输卵管端夹闭，由阴道端插入天上午，取出孕子宫，将输卵管端夹闭，由阴道端插入5号针头号针头注入冲胚液，至宫腔达到一定压力，突然松开输卵管侧，即可获得发育注入冲胚液，至宫腔达到一定压力，突然松开输卵管侧，即可获得发育至囊胚期的早期胚胎。选取发育良好的囊胚接种在至囊胚期的早期胚胎。选取发育良好的囊胚接种在饲养层细胞饲养层细胞上。上。从小鼠囊胚的内细胞群中分离从小鼠囊胚的内细胞群中分离(fnl)培养培养ESC子宫子宫(zgng)第十六页，共四十五页。小鼠早期胚胎的体外培养小鼠早期胚胎的体外培养-饲养层饲养层：饲养层细胞的作用：饲养层细胞的作用：培养的鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素培养的鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，可用作饲养层细胞。处理后，可用作饲养层细胞。饲养层细胞经丝裂霉素饲养层细胞经丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但仍然保持生存处理后，虽然失去分裂能力，但仍然保持生存(shngcn)活性，并为胚胎干细胞的存活性，并为胚胎干细胞的存活、增殖和未分化状态的维持提供一些必需因子，还可去除培养环境中的毒素和代谢活、增殖和未分化状态的维持提供一些必需因子，还可去除培养环境中的毒素和代谢抑制因子。抑制因子。饲养层细胞的处理方法如下：饲养层细胞的处理方法如下：取取P12-16的孕鼠，剖腹取胚胎，去除头、四肢、内脏后，的孕鼠，剖腹取胚胎，去除头、四肢、内脏后，Hanks液反复冲洗，剪液反复冲洗，剪碎鼠胚组织，胰酶消化成单细胞悬液，接种，即为原代培养鼠胚成纤维细胞。将碎鼠胚组织，胰酶消化成单细胞悬液，接种，即为原代培养鼠胚成纤维细胞。将原培养液弃去，加入含原培养液弃去，加入含10g/ml丝裂霉素丝裂霉素C的培养液作用的培养液作用2-4h，然后胰酶消化制成单细胞，然后胰酶消化制成单细胞悬液，接种在四孔板中备用。悬液，接种在四孔板中备用。从小鼠囊胚的内细胞从小鼠囊胚的内细胞(xbo)群中分离培养群中分离培养ESC第十七页，共四十五页。小鼠早期胚胎小鼠早期胚胎(piti)的体外培养：的体外培养：从小鼠囊胚的内细胞从小鼠囊胚的内细胞(xbo)群中分离培养群中分离培养ESC第十八页，共四十五页。ESC的分离培养的分离培养：待小鼠囊胚贴壁，并从透明带中孵出后，在显微操作仪下分离内细待小鼠囊胚贴壁，并从透明带中孵出后，在显微操作仪下分离内细胞团，吸出内细胞团，用胰酶消化，将其离散胞团，吸出内细胞团，用胰酶消化，将其离散(lsn)成小的细胞团块，成小的细胞团块，接种于新的铺有接种于新的铺有饲养层细胞饲养层细胞的四孔板中。一周后即可出现的四孔板中。一周后即可出现ESC集落。集落。从小鼠囊胚的内细胞从小鼠囊胚的内细胞(xbo)群中分离培养群中分离培养ESC第十九页，共四十五页。ESC的分离培养的分离培养-饲养层饲养层：ESC体外培养的条件非常严格，为了维持体外培养的条件非常严格，为了维持ESC的未分化状态的未分化状态(zhungti)，在在体外培养过程中，必须有饲养层或其它分化抑制剂的支持，体外培养过程中，必须有饲养层或其它分化抑制剂的支持，适宜的饲养层培养体系适宜的饲养层培养体系是是ESC体外培养扩增的一个关键环节。体外培养扩增的一个关键环节。从小鼠囊胚的内细胞群中分离从小鼠囊胚的内细胞群中分离(fnl)培养培养ESC原代鼠胚成纤维细胞原代鼠胚成纤维细胞（primary mouse embryonic fibroblast，PMEF）以其易以其易于取材、分化抑制效果好等特点而被广泛应用。于取材、分化抑制效果好等特点而被广泛应用。目前常用的饲养层有：目前常用的饲养层有：STO（SIM小鼠成纤维细胞株，并为抗硫小鼠成纤维细胞株，并为抗硫 代鸟嘌呤代鸟嘌呤6-thioguanine和鸟本箭毒素甙鸟巴因和鸟本箭毒素甙鸟巴因oualiain选择过的选择过的 细胞细胞）、PMEF(原代原代培养鼠胚成纤维细胞培养鼠胚成纤维细胞)、SNL(G418R基因和基因和 LIF基因转染的基因转染的STO）、HBC-5637等。等。随着对人随着对人ESC研究的深入，来源于人研究的深入，来源于人ESC的组织器官可望用于的组织器官可望用于 临床。在临床。在体外培养人体外培养人ESC时多使用时多使用PMEF作为饲养层，这样在作为饲养层，这样在 ESC用于临床治疗时，用于临床治疗时，可能带来鼠源性蛋白的污染而引起不良可能带来鼠源性蛋白的污染而引起不良 反应，所以有人反应，所以有人(yu rn)尝试利用尝试利用人胚胎人胚胎成纤维细胞成纤维细胞作饲养层进行人作饲养层进行人 ESC的培养，并已有成功的报道。的培养，并已有成功的报道。饲养层细胞的抑分化功能来源于基质中的白血病抑制因子饲养层细胞的抑分化功能来源于基质中的白血病抑制因子（leukemia inhibiting factor,LIF），LIF最早于最早于1988年在小鼠年在小鼠Krebs腹水瘤细胞条腹水瘤细胞条件培养基中被纯化的，是一种典型的多功能细胞因子。如：抑制骨髓白件培养基中被纯化的，是一种典型的多功能细胞因子。如：抑制骨髓白血病血病 m1细胞的增殖，诱导其向巨噬细胞方向分化；促进外周胆碱能神经分细胞的增殖，诱导其向巨噬细胞方向分化；促进外周胆碱能神经分化和功能成熟；刺激破骨细胞增殖；调节肝细胞急性期反应蛋白的合成；化和功能成熟；刺激破骨细胞增殖；调节肝细胞急性期反应蛋白的合成；抑抑制多能胚胎干细胞的分化制多能胚胎干细胞的分化等。等。有学者向有学者向ESC培养基中加入培养基中加入LIF以取代饲养层细胞，辅以条件培养基以取代饲养层细胞，辅以条件培养基即可维持即可维持ESC的多能性，从而消除饲养层细胞的干扰。的多能性，从而消除饲养层细胞的干扰。第二十页，共四十五页。ESC的纯化的纯化：待四孔板内长满待四孔板内长满ESC集落，未出现分化集落，未出现分化 征象之前，征象之前，用玻璃针挑取用玻璃针挑取ESC集落，用集落，用 胰酶消胰酶消化，反复吹打离散后重新接种。化，反复吹打离散后重新接种。集落呈克隆状生长，与饲养集落呈克隆状生长，与饲养(syng)层细胞之间层细胞之间 有明有明显的界限，细胞排列紧密，界限不显的界限，细胞排列紧密，界限不 清，可见折光性比清，可见折光性比较强的分裂相。较强的分裂相。从小鼠囊胚的内细胞群中分离从小鼠囊胚的内细胞群中分离(fnl)培养培养ESC第二十一页，共四十五页。ESC特异性表面特异性表面(biomin)标记标记从小鼠囊胚的内细胞从小鼠囊胚的内细胞(xbo)群中分离培养群中分离培养ESC第二十二页，共四十五页。ESC的鉴定的鉴定-嵌合体制备技术：嵌合体制备技术：嵌合体嵌合体（chimera）是指由两种或两种以上不同遗传构成的细胞是指由两种或两种以上不同遗传构成的细胞 构成的个构成的个体，这种个体的组织器官由基因型不同的细胞群组成。体，这种个体的组织器官由基因型不同的细胞群组成。ESC能广泛能广泛(gungfn)参与宿主各组织的形成，尤其是生殖系的形成，成参与宿主各组织的形成，尤其是生殖系的形成，成 为嵌合体制为嵌合体制备的最佳实验材料。备的最佳实验材料。嵌合体的成功制备也是证明嵌合体的成功制备也是证明ESC具有发育全能性的一个金指标。具有发育全能性的一个金指标。从小鼠囊胚的内细胞群中分离从小鼠囊胚的内细胞群中分离(fnl)培养培养ESC嵌合体动物嵌合体动物(dngw)的制备方法主要有三种：融合法、显微注射法和共培养法。的制备方法主要有三种：融合法、显微注射法和共培养法。融合法融合法是指将来源于不同品系动物的早胚消化去透明带后，在融合剂（多用植物血球凝集素）是指将来源于不同品系动物的早胚消化去透明带后，在融合剂（多用植物血球凝集素）的作用下，形成融合胚。实验过程中，由于消化剂、融合剂的使用，会对胚胎造成不的作用下，形成融合胚。实验过程中，由于消化剂、融合剂的使用，会对胚胎造成不同程度的损伤，所以融合法制备嵌合胚的成功率较低。同程度的损伤，所以融合法制备嵌合胚的成功率较低。共培养法共培养法是将着床前的早期胚胎与是将着床前的早期胚胎与ESC进行共培养而获得嵌合胚的一种方法。虽然有资料进行共培养而获得嵌合胚的一种方法。虽然有资料表明，粘附在早期胚胎滋养层外面的表明，粘附在早期胚胎滋养层外面的ESC，经过过夜培养，能有效的与宿主，经过过夜培养，能有效的与宿主ICM细细胞整合，但是在共培养过程中，很难控制发生整合的胞整合，但是在共培养过程中，很难控制发生整合的ESC的数目，因此也限制的数目，因此也限制了其使用。了其使用。显微注射法显微注射法应用最为广泛。通过显微注射法构建嵌合体是一项复杂的技术，应用最为广泛。通过显微注射法构建嵌合体是一项复杂的技术，ESC本身的特性、本身的特性、受体胚胎的品系来源以及显微注射的熟练程度等都会直接影响嵌合体的获得。受体胚胎的品系来源以及显微注射的熟练程度等都会直接影响嵌合体的获得。第二十三页，共四十五页。第一(dy)部分 C57BL/6J inbred mice KMoutbred miceES cell cultureSinglecell suspension5-10 ESCmicromanipulatorreimplantation chimeraspseudopregnant foster mother(KM)第二十四页，共四十五页。ESC的鉴定的鉴定-嵌合体制备技术的应用：嵌合体制备技术的应用：目前，嵌合体制备技术已广泛应用于发育生物学、神经生物学、目前，嵌合体制备技术已广泛应用于发育生物学、神经生物学、遗传学、肿瘤遗传学、肿瘤学、毒理学等众多研究领域，在当今生物医学研学、毒理学等众多研究领域，在当今生物医学研 究中发挥着愈来愈重要的作究中发挥着愈来愈重要的作用。用。在制备嵌合体之前，可以在制备嵌合体之前，可以对对ESC进行基因操作进行基因操作，获取，获取(huq)一些优良一些优良 性状，性状，利用基因操作成功的利用基因操作成功的ESC进行嵌合体的制备，如果出现进行嵌合体的制备，如果出现 生殖系嵌合，就可以把生殖系嵌合，就可以把优良性状遗传下去。在家畜品种改良方优良性状遗传下去。在家畜品种改良方 面有广泛的应用。面有广泛的应用。从小鼠囊胚的内细胞群中分离从小鼠囊胚的内细胞群中分离(fnl)培养培养ESC第二十五页，共四十五页。人胚胎人胚胎(piti)着床前的发育过程着床前的发育过程：从人囊胚的内细胞群中分离从人囊胚的内细胞群中分离(fnl)培养培养ESCtotipotencypluripotency第二十六页，共四十五页。ESC的诱导分化的诱导分化：细胞分化细胞分化cell differentiation：在个体发育中，由一种相同：在个体发育中，由一种相同(xin tn)的细胞的细胞 类型类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生各不相同产生各不相同(xin tn)的细胞类群的过程。的细胞类群的过程。诱导诱导induction：胚胎中的一个区域影响另一个区域，使其沿一条胚胎中的一个区域影响另一个区域，使其沿一条 新途径进新途径进行分化；某些环境因子的刺激使基因进入转录状态。行分化；某些环境因子的刺激使基因进入转录状态。ESC的诱导分化：的诱导分化：胚胎干细胞在外界因素的刺激下逐渐发育为具胚胎干细胞在外界因素的刺激下逐渐发育为具 有特殊形态和功能有特殊形态和功能的专一细胞的过程。的专一细胞的过程。ESC的诱导分化第二十七页，共四十五页。干细胞移植治疗干细胞移植治疗ESC分化形成的功能分化形成的功能细胞就可以用于替代细胞就可以用于替代病变的功能细胞来行病变的功能细胞来行使功能。使功能。目前，在体外通过加入一些诱导目前，在体外通过加入一些诱导剂或细胞因子进行诱导分化实验，剂或细胞因子进行诱导分化实验，还很难模拟体内的正常分化过程，还很难模拟体内的正常分化过程，任何一个诱导体系都不能保证诱任何一个诱导体系都不能保证诱导导ESC定向分化为某一类型细胞，定向分化为某一类型细胞，只能只能(zh nn)使某种类型的细使某种类型的细胞趋于优势。胞趋于优势。ESC的诱导分化第二十八页，共四十五页。ESC的诱导分化第二十九页，共四十五页。ESC诱导分化的常用方法诱导分化的常用方法(fngf):1.加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和和RA等等 2.将将ESC与特定的细胞共培养与特定的细胞共培养 3.将某种分化诱导因子的基因转入将某种分化诱导因子的基因转入ESC内内 ESC的诱导分化第三十页，共四十五页。ESC的神经诱导的神经诱导：1.维甲酸维甲酸（retinoic acid，RA）诱导诱导：维甲酸是维生素在体内的活性衍生物,是一种很强的分化诱导剂,它可诱导类胚体分化成多种细胞类型(lixng),其分化方向取决于维甲酸的作用阶段及剂量。RA进入靶细胞后，由CRABP运送至细胞核，与核受体（RAR和 RXR）结合。RXR自身或者与其他受体结合成同 二聚体或异二聚体,识别DNA上维甲酸反应元件(RARE或RXRE),调控靶基因的表达，发挥重要的生物学效应，如调节细胞的分化、增殖和程序化死亡等。ESC的诱导分化1982年Jones-Willeneuve首次报道将RA运用(ynyng)于胚胎癌细胞（P19）向神经元细胞和神经胶质细胞的诱导,在24-48h内有神经样细胞移出。Jones-Villeneuve EM,McBurney MW,Rogers KA,Kalnins VI.Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.J Cell Biol.1982 Aug;94(2):253-62.1995年Bain等人提出的“八日诱导程序”，即“4-/4+法”，是最经典的RA诱导法。他们将未分化的小鼠ES吹散(chu sn)，悬浮培养4天形成类胚体，再向培养液中加入0.5M RA，培养4天，发现有38%的神经元样细胞。Bain G,Kitchens D,Yao M,Huettner JE,Gottlieb DI.Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.Dev Biol.1995 Apr;168(2):342-57.在胚胎细胞的正常分化过程中，诱导过程的实现不仅依赖于诱导物的诱导作用，同时也依赖于被诱导细胞的反应性，还有赖于两者之间在时间上和空间上的协调同步，这样才能保证被诱导细胞定向地分化为某种类型的细胞。2.序贯诱导法序贯诱导法：2000年Lee等使用“五步法”序贯诱导小鼠ESC向神经细胞分化。扩增未分化的ESC；去除促有丝分裂素或分化抑制剂，悬浮培养，形成类胚体;去除生长因子，促分化，筛选nestin阳性细胞；扩增神经前体细胞；利用神经元促存活因子诱导并维持特定谱系神经元成熟。3.神经分化的内定模式神经分化的内定模式（default model）：在对脊椎动物神经发育的研究中，有人发现外胚层细胞在无 外界诱导信号下自发分化为神经细胞。经典的例子：Tropepe等人的实验发现，低密度、无血清、无 饲养层的小鼠ESC培养7天后有0.2%左右的细胞可聚集形成神 经球，其中82%的细胞呈nestin阳性着色。证明ESC能够自发分化为神经元。神经分化的内定模式认为在胚体原基中，神经谱系的分化受着某种抑制信号的控制，神经分化是抑制信号撤除后自发获得的一种状态。有资料表明：BMP4与这种抑制信号的转导密切相关，使用BMP4的拮抗剂Noggin、Chordin可抑制这种抑制信号的传导，从而促进ESC的神经分化。4.基因修饰基因修饰：将神经特异性基因转染入ESC，筛选即可得到高纯度的神经细胞。将Nestin（神经前体细胞标志物）与报告基因增强性绿色荧光蛋白共 同转染入ESC，筛选可得到高纯度的神经前体细胞。将促多巴胺能神经元生成的转录因子Nurr1转染入ESC，即可得到 Nurr1 ESC系，再通过五步序贯诱导法，即可得到50%多巴胺能神经 元，成为帕金森氏病细胞移植治疗的一个新的细胞来源。随着对神经发育分子机制的逐步了解，越来越多的与神经发生相关的基因被定位，这将为转染干细胞的研究提供更准确、有效的靶基因信息，前景非常诱人。但是由于基因修饰导致的基因组不稳定，导入基因可能引起的异常基因的表达，都需要学者进行进一步研究。第三十一页，共四十五页。哺乳动物的发育均需由1个全能细胞(受精卵)分化形成200多种不同类型的细胞。从囊胚期内细胞群分离得到的ESC在体外也具有无限或较长期的自我更新能力，并能在特定(tdng)的诱导条件下分化为各种组织特异性细胞。第三十二页，共四十五页。干细胞的调控是指给予适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向(fngxing)发展。内源性调控 外源性调控基因调控基因调控-干细胞应用干细胞应用(yngyng)(yngyng)的的基础基础第三十三页，共四十五页。哺乳动物的发育均需由1个全能细胞(受精卵)分化形 成200多种不同类型(lixng)的细胞。从囊胚期内细胞群分离得到的ESC在体外也具有无限或较长期的自我更新能力，以及强大的分化潜能，能在特定的诱导条件下分化为各种组织特异性细胞。而且干细胞的增殖分化干细胞的增殖分化是是可可以受基因以及细胞外基质以受基因以及细胞外基质调控调控的。的。干细胞增殖分化的可调控性为干细胞带来了广阔的应用前景。干细胞增殖分化的可调控性为干细胞带来了广阔的应用前景。理论上讲，干细胞可以用于许多疾病的治疗，像帕金森氏 病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭、血液系统疾病等。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。细胞替代治疗细胞替代治疗制备制备(zhbi)转基因动物转基因动物第三十四页，共四十五页。ESC的应用的应用-细胞替代治疗细胞替代治疗：最适合的疾病主要是组织最适合的疾病主要是组织(zzh)坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病 变如变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病、白血病等。帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病、白血病等。ESC的应用ESC移植移植(yzh)治疗的模式图治疗的模式图 ESC技术技术(jsh)+转基因技术转基因技术(jsh)随着对个体发育分子机制的逐步了解，随着对个体发育分子机制的逐步了解，越来越多的与越来越多的与组织发生相关的基因组织发生相关的基因被定被定位，这将为转染干细胞的研究提供更准确、位，这将为转染干细胞的研究提供更准确、有效的靶基因信息，实现相对定向诱导分有效的靶基因信息，实现相对定向诱导分化，前景非常诱人。化，前景非常诱人。但是由于但是由于基因修饰导致的基因组不稳基因修饰导致的基因组不稳定定，导入基因可能引起的异常基因的表达导入基因可能引起的异常基因的表达，都需要学者进行进一步研究。都需要学者进行进一步研究。第三十五页，共四十五页。源于胚胎源于胚胎(piti)干细胞的细胞已能或可能治疗许多疾病：干细胞的细胞已能或可能治疗许多疾病：神经细胞神经细胞心肌细胞心肌细胞B B型胰岛细胞型胰岛细胞软骨细胞软骨细胞白细胞白细胞皮肤细胞皮肤细胞肝细胞肝细胞骨细胞骨细胞视细胞视细胞骨骼肌细胞骨骼肌细胞帕金森病帕金森病心肌梗死心肌梗死糖尿病糖尿病骨关节炎骨关节炎白血病白血病烧伤和创伤烧伤和创伤肝炎肝炎骨质疏松症骨质疏松症视网膜退化视网膜退化肌营养不良肌营养不良治疗(zhlio)ESC的应用第三十六页，共四十五页。利用利用ESC移植治疗疾病确实具有广泛的应用前景，但是胚胎干细胞移植治疗疾病确实具有广泛的应用前景，但是胚胎干细胞通常取自通常取自4-54-5天的早期胚胎，在分离过程中不可避免会损毁所使用天的早期胚胎，在分离过程中不可避免会损毁所使用早期胚胎，因此该项研究在欧美早期胚胎，因此该项研究在欧美受到了社会伦理学的制约受到了社会伦理学的制约，并且在，并且在实际应用中还实际应用中还不能避免免疫排斥不能避免免疫排斥。核移植技术逐渐引起各国学者的关注。人们可望核移植技术逐渐引起各国学者的关注。人们可望(k wn(k wn)通过核移植技通过核移植技术获得杂合细胞发育成的囊胚，获得多能干细胞术获得杂合细胞发育成的囊胚，获得多能干细胞，然后将这些细胞回输入体内，然后将这些细胞回输入体内，从而达到治疗的目的。从而达到治疗的目的。核移植技术核移植技术第三十七页，共四十五页。核移植技术核移植技术 1938年,Speman H在Embryonic Development and Induction一书中提出了将分化了的细胞核移入去核卵细胞中看其是否能指导胚胎发育的异想天开的设想。1952年,Briggs R和King T通过移植蛙的胚胎细胞核到去核的卵子中得到发育正常的蝌蚪。1981年,Illmensee K和Hoppe PC声称通过核移植技术获得成活的小鼠。1997年,Wilmut I用成体(chn t)乳腺细胞核移植克隆羊成功，“多莉”羊的出现震惊了世界,也使克隆clone一词成为家喻户晓的词汇。第三十八页，共四十五页。核移植技术核移植技术(jsh)(jsh)困难重重困难重重克隆羊多莉克隆羊多莉Dolly的诞生的诞生 个体个体(gt)第三十九页，共四十五页。克隆羊多莉克隆羊多莉Dolly：1997年2月22日，英国生物遗传学家维尔穆特成功 地克隆出了一只羊。克隆羊“多莉”的诞生震惊了世界。“多莉”是世界上第一例用体细胞-乳腺上皮细胞，通 过细胞核移植技术，得到的一只小绵羊。多莉羊的诞生揭示一个全新概念：由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生命个体命个体。克隆猴子克隆猴子Tetra：2000年，美国(mi u)俄勒冈地区灵长类动物研究中心的研究小组最近在著名的科学杂志上发表了他们克隆猕猴的成果。克隆人的成功克隆人的成功：2002年12月克隆公司Clonaid法国成员Brigitte Boisselier表示，世界上第一个复制婴儿诞生。2003年1月意大利妇科医生Severino Antinori称有复制人的妇女将生下婴儿。2009年3月，法新社报道，他已“制造”出3名“克隆人”，如今已有9岁。牛,猪,马,骡子,猫,狗,兔等动物相继(xingj)被克隆。带来世人的惊慌带来世人的惊慌此项研究用了约434个卵子(lunz),获得277个重构卵,移植到中间受体6 后，冲出247个胚胎,其中发育到桑椹胚和囊胚的29个(11.7%)。把29个胚胎移植给13只代母，最后生出1只“多莉”,产羔率仅为3.4%。若以重构卵数计算,产羔率低于4。第四十页，共四十五页。克隆个体存在缺陷：被克隆动物即使能够出生，仍会有严重的不正常变异，巨大被克隆动物即使能够出生，仍会有严重的不正常变异，巨大(jd)(jd)，寿命短，寿命短 表面上看起来正常的动物，也存在异常的基因表达模式表面上看起来正常的动物，也存在异常的基因表达模式 发育过程中各阶段都会存在失控（发育过程中各阶段都会存在失控（epigenetic dysregulation）第四十一页，共四十五页。治疗性克隆在中国治疗性克隆在中国 “治疗性克隆”课题被列为国家级重点基础研究项目。此课题分为上、中、下游三块：上海市转基因研究中心成国祥教授负责上游研究 上海第二医科大学盛惠珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。其整体目标是，用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定 的处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织(zzh)或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织(zzh)或器官移植到病人身上，从根本上解决同种异体器官移植过程中最难解决的免疫排斥反应。组织工程组织工程“人耳鼠人耳鼠”的制备：的制备：先用一种高分子化学材料聚羟基乙酸做成人耳的模型支架，让细胞在这个支架上繁殖生长，然后，在裸鼠的背上割开一个口子，将已经培养好的“人耳”植入后缝合。“人耳”支架最后会自己降解消失，于是，“人耳”便与老鼠(lo sh)浑然成为一体。干细胞为组织工程提供了一种很好的种子细胞。第四十二页，共四十五页。ESC的应用的应用-转基因动物的制备转基因动物的制备：外源目的基因的制备；外源目的基因的导入（受精卵或ESC）；转基因胚胎移植；筛选(shixun)转基因动物品系。外源目的(md)基因的制备-利用限制性核酸内切酶，从基因组中获取目的基因；利用RNA合成cDNA；人工体外合成DNA片段；PCR扩增特定基因片段。第四十三页，共四十五页。转基因动物的应用领域主要有：疾病的动物模型：尤其是单基因遗传病。用于研究疾病的发病机理、药物筛选、药物治疗、毒物测试；通过(tnggu)导入或剔除基因（knock-in or knock-out）来研究基因的功能、调控和发育，如癌基因、发育基因等；生物反应器：药用或食品蛋白的大量生产，即转基因动物制药；异种器官的移植；家畜品种