黄喉拟水龟Cathelicidin基因克隆及表达分析.pdf
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1、5期1559黄喉拟水龟Cathelicidin基因克隆及表达分析魏华1,谭雯予1,吴志刚1,杨祖鹏1,张洪耀1,韩书煜2,施金谷2,黄德生3,梁静真1*,黄钧1*(1广西大学动物科学技术学院/广西水生动物病害诊断实验室/广西高校水生生物健康养殖与营养调控重点实验室,广西南宁530004;2广西水产技术推广站,广西南宁530022;3合浦县水产技术推广站,广西北海536199)摘要:【目的】克隆黄喉拟水龟(Mauremys mutica)Cathelicidin基因(MmCath)并分析其组织表达特征,为深入研究MmCath基因在黄喉拟水龟先天免疫中的潜在作用提供理论依据。【方法】运用RACE克
2、隆黄喉拟水龟MmCath基因cDNA序列,利用生物信息学软件进行序列特征分析,并通过实时荧光定量PCR检测MmCath基因在黄喉拟水龟不同组织中的表达特征及细菌攻毒后的表达情况。【结果】MmCath基因cDNA序列全长777 bp,包括63 bp的5非编码区、483 bp的开放阅读框(ORF)和231 bp的3非编码区。MmCath基因编码160个氨基酸残基,包括N端的信号肽区,含有4个保守半胱氨酸(Cys)残基的Cathelin肽区和C端的成熟肽区,符合Cathelicidins蛋白家族典型特征。MmCath前体蛋白相对分子质量为17.74 kD,理论等电点(pI)为5.27,其二级结构中-
3、螺旋占31.25%,无规则卷曲占20.63%,-折叠占48.12%。黄喉拟水龟MmCath前体蛋白氨基酸序列与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)Cathelicidin氨基酸序列的相似性最高,达80.63%,亲缘关系最近。MmCath基因在黄喉拟水龟的表达具有组织差异性,以脾脏和肝脏中的相对表达量较高,在表皮、心脏、肾脏、肺脏、脑、肠道和肌肉等组织中的相对表达量较低;嗜水气单胞菌(Aeromonas hy-drophila)攻毒后MmCath基因表达上调,在攻毒后第3和第6 h其相对表达量极显著高于攻毒前(0 h)的相对表达量(P0.01,下同),之后有所下降,在攻毒后第
4、36 h再极显著上升,随后下降。【结论】从黄喉拟水龟中克隆的MmCath基因属于Cathelicidins基因家族,参与了黄喉拟水龟抗病原感染过程,可为有效控制黄喉拟水龟细菌性疾病提供新思路。关键词:黄喉拟水龟;Cathelicidin基因;基因克隆;表达特征中图分类号:S947.1文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)05-1559-09收稿日期:2023-01-23基金项目:广西自然科学基金项目(2018GXNSFAA138167)通讯作者:梁静真(1986-),https:/orcid.org/0000-0002-6970-1548,博士,主要从事水产养殖及病害防治研究工
5、作,E-mail:;黄钧(1957-),https:/orcid.org/0009-0003-6373-2057,教授,主要从事水生动物病害防控技术研究工作,E-mail:第一作者:魏华(1994-),https:/orcid.org/0009-0006-1083-3083,研究方向为水产养殖及病害防治,E-mail:727654648 南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(5):1559-1567ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.05.028
6、Cloning and expression analysis of Cathelicidin gene inMauremys muticaWEI Hua1,TAN Wen-yu1,WU Zhi-gang1,YANG Zu-peng1,ZHANG Hong-yao1,HAN Shu-yu2,SHI Jin-gu2,HUANG De-sheng3,LIANG Jing-zhen1*,HUANG Jun1*(1College ofAnimal Science and Technology,Guangxi University/Guangxi Laboratory ofAquaticAnimal D
7、iseaseDiagnosis/Guangxi University Key Laboratory ofAquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation,Nanning,Guangxi 530004,China;2Guangxi General Station ofAquaculture Technology Extension,Nanning,Guangxi 530022,China;3Hepu Station ofAquaculture Technology Extension,Beihai,Guangxi 536199,China)Abs
8、tract:【Objective】The Cathelicidin gene of Mauremys mutica(MmCath)was cloned and its tissue expression pat-tern was analyzed,so as to provide theoretical foundation for further studying the potential function of MmCath gene inthe innate immunity of M.mutica.【Method】The cDNA sequence of the MmCath gen
9、e of M.mutica was cloned by RACE.Sequence analysis was conducted by bioinformatics software.The expression patternof MmCath gene in different tissuesof M.mutica and its expression change after bacterial challenge were identified by real-time fluorescence quantitativePCR.【Result】The full length of th
10、e cDNA sequence of MmCath gene was 777 bp,including a 5 noncoding region of 63bp,an open reading frame(ORF)of 483 bp,and a 3 noncoding region of 231 bp.The MmCath gene encoded 160 amino54卷南 方 农 业 学 报 15600引言【研究意义】黄喉拟水龟(Mauremys mutica)俗称石龟,隶属于龟科拟水龟属(马风娟等,2020),药用和经济价值均较高(牟超盛等,2021),自20世纪80年代开始人工养殖,目
11、前在广西、广东和海南等地养殖量较大(李爵乾和杨火廖,2018)。在高密度饲养条件下,黄喉拟水龟病害不断暴发,给其养殖业带来巨大经济损失,而养殖户滥用或乱用抗生素极易引发细菌耐药及食品安全问题。Cathelicidins是脊椎动物特有的抗菌肽家族之一,也是动物先天免疫的重要组成部分,具有广谱抗微生物活性且不容易产生耐药性(Yacoub et al.,2016;王妍等,2021)。因此,克隆黄喉拟水龟Cathelicidin基因(MmCath)并分析其组织表达特征,对进一步了解黄喉拟水龟的先天免疫系统及促进黄喉拟水龟养殖业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】基因Cathelicidins最早发现
12、于牛嗜中性粒细胞和猪骨髓细胞中(董锐等,2017),随后陆续在灵长类、有蹄类和啮齿类等哺乳类动物中发现(陈晨,2017),随着研究领域的不断扩大,近年来还在非哺乳类的鸟类、爬行类、两栖类和鱼类中发现Cathelicidins基因(Chang et al.,2006;甘同香,2008;陈晨,2017)。龟鳖类已发现Cathelicidins基因的物种包括黄沙鳖(Truogx sinensis)(马沙等,2019)、西部锦龟(Chrysemys picta bellii)、海龟(Che-lonia mydas)(Qiao et al.,2019)及中华鳖(Pelodis-cus sinensis)
13、(Shi et al.,2019)等。各种来源的Cat-helicidins前体蛋白具有相似的结构特征,包含N端的信号肽区、有4个保守半胱氨酸残基的Cathelin肽区及C端高度特异的成熟肽区(王妍等,2021)。Cathe-licidin前体蛋白通常无生物活性,需经特定蛋白酶酶切作用后才能释放出具有活性的成熟肽(Sun et al.,2015)。Cathelin肽区含有数量较多并带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸残基,可中和富含正电荷的成熟肽区,使Cathelicidins前体蛋白维持无活性状态,避免损伤自身细胞(广慧娟,2013;王妍等,2021)。已有研究认为,富含正电荷的Cathelicidi
14、ns成熟肽容易吸附在带负电荷细菌的细胞膜表面(王晨等,2017;彭练慈等,2022),通过与细菌细胞膜的阴离子磷脂或与革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(LPS)相互作用以杀灭细菌,不易引起细菌耐药性(Bucki et al.,2004)。Cathelicidins成熟肽除具有抗菌活性外,还参与宿主的各种防御性生理进程,如抗氧化、抑制组织损伤和免疫调节等(王晨等,2017)。Tomasinsig等(2010)研究指出,牛Cathelicidin BMAPs成熟肽可诱导乳腺上皮细胞中TNF-a因子表达;Veldhuizen等(2014)研究表明,猪Cathelicidin PR-39成熟肽能诱导宿主细胞
15、的白细胞介素-8和肿瘤坏死因子TNF-a表达,可抑制TNF-a因子引起的感染;杨俊(2019)研究认为,高原腹斑倭蛙(Nanorana ventripunctata)的Cathelicidin-NV成熟肽具有抑制组织损伤能力;罗暄巾(2021)研究发现,贵州疣螈(Tylototriton kweichowe-nsis)的Cathelicidin成熟肽(TK-CATH)能抗炎、抗氧化和促进伤口愈合。【本研究切入点】目前,关于黄喉拟水龟MmCath基因克隆及其基因表达特征的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过克隆MmCath基因并分析其在黄喉拟水龟组织的分布特征及细菌攻毒后的表达情况,探究MmC
16、ath基因在黄喉拟水龟先天免疫中的潜在作用,为促进黄喉拟水龟养殖业健康发展提供参考依据。acid residues,which contained the signaling peptide region at the N terminus,the Cathelin peptide region with 4 con-served cysteine(Cys)residues,and the mature peptide region at C terminus,in accordance with the typical family characte-risticsofCathelicidi
17、nsproteinfamily.MmCathprecursorproteinhadarelativemolecularweightof17.74kDaandtheoreticalisoelectric point(pI)of 5.27.In its secondary structure,-helix accounted for 31.25%,random coil 20.63%and-turn48.12%.The amino acid sequence of MmCath precursor protein shared a highest sequence similarity(80.63
18、%)and closestgenetic relationship with the amino acid sequence of Cathelicidin in Chrysemys picta bellii.Expressions of MmCath genewere different in various tissues in M.mutica.Its higher relative expressions were shown in spleen and liver,while the re-lative expressions were lower in the tissues li
19、ke skin,heart,kidney,lung,brain,intestine,and muscle.Up regulation ofexpression was shown in MmCath gene after the challenge of Aeromonas hydrophila.The relative expression levels at 3and 6 h were extremely significantly higher than that at before challenge(0 h)(P0.01,the same below),and thendecreas
20、ed.It markedly increased again at 36 h post challenge and decreased afterwards.【Conclusion】The MmCath genecloned from M.mutica belongs to the Cathelicidins gene family.It involves in the process of resisting attack of invadingpathogen of M.mutica and can provide new ideas for effective control of ba
21、cterial diseases of M.mutica.Key words:M.mutica;Cathelicidin gene;gene cloning;expression patternFoundation items:Guangxi Natural Science Foundation(2018GXNSFAA138167)5期15611材料与方法1.1试验材料健康黄喉拟水龟购自广西凭祥市某龟鳖养殖场,体质量约69.420.1 g。经30 d养殖观察及抽样检测,确定黄喉拟水龟健康未携带病原后用于攻毒试验。攻毒试验采用的嗜水气单胞菌(Aeromonashydophila)分离自广西患病黄
22、喉拟水龟,经鉴定后保存于-80 冰箱,在使用前再次进行生化鉴定和分子鉴定。TRIzol试剂和DNA聚合酶购自广西南宁博美生物科技有限公司;SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒和PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;实时荧光定量PCR混合酶2SYBR Green qPCR Mix购自北京康润诚业生物科技有限公司。1.2试验方法1.2.1RNA提取及cDNA合成采用TRIzol法提取总RNA,以紫外分光光度计测定其纯度和浓度。基因克隆使用SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒反转录合成cDNA;
23、基因组织分布分析使用PrimeScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录。1.2.2引物设计及基因克隆首先,根据NCBI已公布的龟鳖类Cathelicidins基因序列,设计3端克隆引物MmCath-F1和MmCath-F2(表1)。然后,以1.2.1中的总RNA为模板,采用SMARTer RACE 5/3 Kit试剂盒进行3端反转录后对MmCath基因3端序列进行PCR扩增,扩增产物连接转化后送至北京六合华大基因科技有限公司测序。根据已获得的MmCath基因3端序列,设计引物MmCath-R1和MmCath-R2(表1),采用SMARTer R
24、ACE 5/3 Kit试剂盒进行5端反转录后以PCR扩增MmCath基因5端序列,序列片段经连接转化后测序。最后,将测序成功的上述片段拼接成完整cDNA序列。利用NCBI的ORFFinder查找开放阅读框(ORF),并以MmCath-ORF-F和MmCath-ORF-R为引物验证ORF。1.2.3MmCath基因在黄喉拟水龟不同组织中的表达分析随机剖检3只健康黄喉拟水龟,取其肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏、肠道、肌肉、脑和表皮的组织样品,按照1.2.1的方法进行总RNA提取和cDNA合成。以MmCath基因序列为依据设计实时荧光定量PCR引物MmCath-qPCR-F和MmCath-qPCR-R
25、,根据NCBI已公布的黄喉拟水龟18S rRNA序列(登录号KP765693.1)设计内参基因18S rRNA引物Mm18S-F和Mm18S-R(表1)。通过实时荧光定量PCR检测MmCath基因的组织表达特异性,采用2-Ct法计算MmCath基因相对表达量。以肌肉组织中MmCath基因相对表达量为1,每个样品设3次重复,采用SPSS22.0中的Duncans新复极差法对MmCath基因的相对表达量进行统计分析。1.2.4MmCath基因在攻毒后的表达情况参考马沙(2019)、许飘尹等(2020)的方法,将嗜水气单胞菌接种于LB琼脂培养基上,28 培养20 h后,挑取适量菌苔重悬于无菌生理盐水
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