基于AMPK信号通路介导的自噬流探讨电针结合运动预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响.pdf
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1、论著基于 信号通路介导的自噬流探讨电针结合运动预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响尹 侠李宏玉朱路文唐 强(.黑龙江中医药大学 黑龙江 哈尔滨.黑龙江中医药大学附属第二医院黑龙江 哈尔滨)摘要 目目的的 基于腺苷酸活化蛋白激酶()介导的自噬流探讨电针结合运动预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制 方方法法 按照随机数字法将 只雄性 大鼠分成对照组、模型组、电针 运动组、电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组每组 只 各预处理组先接受 周电针干预及运动干预然后采用 灌流系统对除对照组外的其他 组大鼠进行心肌缺血再灌注损伤造模(缺血 复灌 )其中电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组分
2、别在造模前 腹腔注射生理盐水和 法检测心肌组织中 含量透射电镜观察心肌组织超微结构免疫组化染色观察心肌组织中转录因子()表达情况 法检测心肌组织中、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()、及、蛋白表达情况 结结果果 模型组大鼠心肌线粒体中 含量明显低于对照组(.)电针 运动组、电针 运动 生理盐水组大鼠心肌线粒体中 含量均明显高于模型组和电针 运动 组(均.)透射电镜观察模型组大鼠心肌细胞胞质中度水肿线粒体肿胀呈圆形基质间隙变宽电针 运动组、电针 运动 生理盐水组大鼠心肌细胞中见自噬小体与散在分布的溶酶体胞质轻度水肿线粒体轻度肿胀电针 运动 组大鼠线粒体轻度水肿嵴密度降低 模型组大鼠心肌组织中 阳性表达较
3、对照组显著增加电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 阳性表达较模型组和电针 运动 组明显减少 电针 运动组、电针 运动 生理盐水组 /比值与蛋白表达量均明显高于模型组和电针 运动 组(均 )/比值与 蛋白表达量均明显低于模型组和电针 运动 组(均 .)结结论论 电 针结合运动预处理可通过信号通路促进自噬流从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤关键词 心肌缺血再灌注电针运动预处理自噬流:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 尹侠女在读博士研究生研究方向为冠心病的中医康复通信作者 唐强 :.基金项目 黑龙江省博士后基金项目()黑龙江中医药大学研究生创新基金()(.)现代中西医结合杂志 ()
4、:().().()().()(.)./(.)/(.).:/冠心病和急性心肌梗死()是人类死亡的主要原因经皮冠状动脉介入治疗()、溶栓治疗是目前最有效的治疗措施但在恢复心肌血氧供应的同时可能会引起心肌缺血再灌注损伤 目前研究认为缺血再灌注损伤的发生机制包括活性氧产生增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞激活和损伤以及自噬等这些有害影响导致心肌细胞死亡、心肌梗死范围扩大、心律失常和血流动力学受损 既往研究证实缺血预适应在再灌注早期可激活自噬并促进受损的自噬流发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用而腺苷酸活化蛋白激酶()作为调节细胞内自噬/溶酶体途径的上游信号通路一直以来都是人们关注的热点
5、课题组前期研究证实运动预处理和电针预处理均可通过调节自噬发挥心肌保护作用 但联合应用对心肌缺血再灌注损伤的影响及机制尚未阐明本研究基于 信号通路及通路下游的相关自噬蛋白的表达变化探讨了电针结合运动预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护机制 实验材料与方法 实验动物 只 级 雄性大鼠体重 购自辽宁长生生物技术有限公司动物许可证号:(辽)饲养于黑龙江中医药大学动物实验中心 保持室内湿度()温度控制在()自然昼夜节律标准饲料喂养自由饮食、饮水 实验仪器与试剂 超低温冰箱和 冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)离现代中西医结合杂志 ()体心脏灌流实验系统(江苏赛昂斯生物技术有限公司)凝胶成像系统(公司)
6、石蜡切片机赛默飞世尔(上海)仪器有限公司荧光正置显微镜()(抑制剂 中国)山羊抗兔 、显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)内参()裂解液(碧云天生物技术有限公司)多聚甲醛(天津光科密欧有限公司)肝素钠注射液(天津生物化学制药有限公司规格:万/)抗体(武汉三鹰 )、(武汉三鹰 )、()、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(武汉三鹰 )实验方法适应性饲养 周后随机将 只 大鼠分为对照组、模型组、电针 运动组、电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组每组 只 各预处理组先接受 周电针干预及运动干预然后采用 灌流系统对除对照组外的其他 组大鼠进行心肌缺血再灌注损伤造模其中电针 运动 生理盐水组、电针 运动 组分别
7、在造模前 腹腔注射生理盐水和 /(./)预处理方法 电针方案:参照实验针灸学取双侧心俞穴(第 胸椎棘突下双侧各旁开约 )、神门穴(前肢内侧腕部横纹尺骨边缘)用华佗牌.毫针直刺连接 电针仪(苏州医疗用品有限公司)电针参数:频率 电压 连续波 每日 次每次 /每周连续干预 取双侧心俞穴并在穴位下方 各刺一针作为参考电极、神门穴(在大鼠尾部针刺一处作为参考电极)负极连接心俞穴、神门穴正极接参考电极处 运动方案:进行电动跑台梯度运动训练跑台起始速度为 /第 天运动时间为 每 运动时间增加 直至运动时间 /每周连续干预 心肌缺血再灌注造模方法腹腔注射 戊巴比妥钠溶液 /麻醉大鼠同时给予肝素钠注射液 /腹
8、腔注射抗凝 固定大鼠开胸后快速取出心脏将其放入 营养液中并充分挤压心脏内血液然后用动脉夹将心脏固定在装置上用 号线结扎采用 液(含 和 )于 下恒温恒压灌流 对照组大鼠心脏灌注 各造模组大鼠灌注 后在无氧和无灌流液的条件下于 下缺血 后复灌 检测指标及方法 线粒体 含量实验结束后用 对心脏进行冲洗滤纸吸干水分放在玻璃皿内置于冰上 用手术刀切取.心肌组织用镊子移至离心管中加入 进行清洗弃掉 溶液将盛有组织的离心管置于冰上用小研磨棒进行均匀研磨加入 冰浴 离心、弃上清加入 胰酶消化液置于冰上 离心、弃上清加入 线粒体分离试剂移液枪混匀离心、弃上清加入 线粒体分离试剂在冰上进行研磨离心后小心把上清转
9、移至新的离心管中离心、弃上清余下的沉淀即为分离得到的心肌线粒体用 相应的线粒体储存液重悬线粒体置于冰上根据 试剂盒说明进行测定计算出 含量 心肌组织超微结构 切取约 大小心肌组织放入 的.戊二醛磷酸缓冲液中固定 然后进行漂洗、梯度丙酮脱水、浸透、包埋、切片(厚度 )、染色透射电镜下观察心肌细胞内自噬小体和自噬溶酶体等结构 心肌组织中转录因子()表达情况切片常规脱蜡至水进行抗原修复将柠檬酸抗原修复液()稀释至 将切片放入塑料染色缸倒入配好的抗原修复液(九分满盖子放在上面不要盖严)微波炉中火加热 冷却至室温 洗 次加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育 缓冲液冲洗 次滴加山羊血清 孵育 以封闭非
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