基于CRISPR_Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2023.0199基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法张敏琳1 黄枫淇1 左小玲1 梁建韬1 梁凯珊1 单金红1 李宗烊1 喻 婕1 罗丽媛1 禤梓杰1 赵会宏1,2 王 庆1,2(1.华南农业大学海洋学院,广州 510642;2.华南农业大学粤港海洋生物资源保护与开发联合实验室,广州 510642)摘要:为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rha-bdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)
2、技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20 L检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/LcrRNA2及500 nm
3、ol/L ssRNA报告探针,在37的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察。研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法。关键词:大口黑鲈弹状病毒;CRISPR-Cas13a;MIRA;大口黑鲈中图分类号:S941.4 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2024)02-0283-09 大口黑鲈(Mic
4、ropterus salmoides)是我国重要的淡水经济鱼类之一,因其肉质鲜美、无肌间刺,加之其适应性强、养殖周期短等优点,深受消费者和养殖者的喜欢,近年来大口黑鲈的养殖出现了快速增长1。目前,我国大口黑鲈年养殖产量已达70万吨,养殖场主要集中分布在广东、江苏、浙江、江西、四川和福建6省份,占全国生产总量的90%以上2。然而,在大口黑鲈的养殖过程中,其病害日趋严重,细菌病和病毒病成为危害其养殖的主要疾病3,其中大口黑鲈弹状病毒(Micropterus sal-moides rhabdovirus,MSRV)危害巨大。该病毒能引起幼鱼嗜睡、漫游、腹部肿胀和体形扭曲,以及诱导坏死性溃疡和多器官出
5、血,一旦感染死亡率超过90%4。MSRV是一种包膜状、短棒状或子弹状的单股负链RNA病毒,能够严重危害大口黑鲈养殖业的发展,该病毒具有传播速度快、死亡率高、防控难度大的特点5。MSRV包含1130011600个核苷酸,包括3非翻译区和5种结构蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶。其中MSRV的3前导区与其他鱼类弹状病毒相比在遗传水平上具有低同源性6。弹状病毒共有9个属,除了一些未被分类的病毒之外,感染鱼类的弹状病毒主要为水泡性口炎病毒属、诺拉弹状病毒属和佩弹状病毒属这3个属7。其中,MSRV属弹状病毒科(Rhabdoviridae),水泡性口炎病毒属(Ve
6、si-culovirus)8,9。每年因MSRV导致的大口黑鲈鱼苗损失超过30%,给大口黑鲈养殖产业发展带来巨大损失。但是目前关于该病毒的治疗和检测方法还第 48 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报Vol.48,No.2 2024 年 2 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAF e b.,2 0 2 4 收稿日期:2023-06-25;修订日期:2023-07-28基金项目:国家自然科学基金面上项目(42176103);国家重点研发计划(2022YFD2400502);广东省自然科学基金面上项目(2022A1515012505)资助 Supported by the Nat
7、ional Natural Science Foundation of China(42176103);the National Key Research andDevelopment Program of China(2022YFD2400502);the Natural Science Foundation of Guangdong Province(2022A1515012505)作者简介:张敏琳(2000),女,在读硕士研究生;研究方向为水产病害防控。E-mail:通信作者:王庆,E-mail:The Author(s)2024.This is an open access artic
8、le under the CC-BY 4.0 License(https:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/).不成熟,尤其是现有检测技术较难做到在无复杂检测设备的情况下开展现场检测。目前关于检测MSRV的方法主要分为组织病理学检测、免疫学检测和分子生物学检测等。组织病理学检测主要是采取鱼的患病组织器官制作石蜡病理切片,后在显微镜下观察组织病理变化10;免疫学检测主要是采用ELISA检测大口黑鲈血清中的G蛋白抗体水平,用以分析MSRV诱导的抗原特异性免疫反应11;分子生物学上经常使用的是聚合酶链式反应(PCR)12、荧光实时定量PCR13等。上述检测方法
9、还存在一些不足之处,如检测方法不够高效方便、检测设备需要专业的温控功能、检测所需时间较长、实验人员需要一定的实验技能等。除此之外,目前关于MSRV还没有有效的治疗方法,故很有必要在感染之前及时发现病毒并做好有效的防范措施,能够在一定程度上减少养殖过程中的损失。因此,开发一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的MSRV检测方法迫在眉睫。CRISPR系统最初是在细菌和古细菌中得到确认14,CRISPR-Cas系统是结合和切割外来核酸的原核适应性免疫系统15。CRISPR-Cas系统主要分为两类:使用多蛋白复合物破坏外来核酸的一类系统,包括型、型和型,以及使用单一蛋白质的二类系统,包括、和型16。型
10、和型系统拥有如下特征:Cas核酸内切酶处理前crRNA,每个crRNA被组装成多Cas蛋白复合物,从而可以识别和切割与crRNA互补的核酸片段。而型系统处理前crRNA的机制不同,其中与前crRNA中重复序列互补的反式激活crRNA(tracrRNA)在Cas9蛋白存在的情况下会触发双链RNA特异性核糖核酸酶RNase的处理17。近年来,CRISPR-Cas13a引发了很多的研究。CRISPR-Cas13a(以前称为C2c2)是一种新表征的单效应子类,型,RNA引导的RNA编辑系统18。Cas13a的序列分析显示存在两个更高的真核和原核核苷酸结合内核糖核酸酶结构域,且不存在DNase催化位点1
11、9。CRISPR-Cas13a具有RNA引导的RNA靶向内切酶和非特异性RNA内切酶活性两种活性,故逐渐被开发为核酸检测的工具18。当Cas13a与crRNA结合后,会形成具有核酸酶活性的核糖核蛋白复合体,当识别到具有互补序列的单链靶标RNA时,会激活Cas13a切割单链靶标RNA20。其切割活动可通过连接的荧光体-淬灭体的ssRNA来检测,被激活的Cas13a会切割ss-RNA导致其裂解后发荧光18,21。基于这一特性,CRISPR/Cas13a的检测已成功应用于检测赤点石斑鱼神经坏死病毒22、猪繁殖与呼吸综合征病毒23和甲型H7N9禽流感病毒24,Cas13a与对应的crRNA结合形成复合
12、物并且与靶向RNA结合时,Cas13a的切割活性被激活以降解非靶向RNA。MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplifi-cation,MIRA)技术是一种基于重组酶恒温核酸快速扩增技术,通过MIRA反应可实现对目标核酸序列的扩增,无须复杂的热循环仪,而是可以通过简单的水浴或加热块在2037的恒定温度下完成。整个反应过程需要3种酶:重组酶,负责将特异性引物与模板DNA配对;单链DNA结合蛋白(SSB),在不加热的情况下形成单链DNA;链置换DNA聚合酶,负责扩增和延伸。反应一旦开始,DNA扩增会迅速进行,并在20min时间内达到可检测的水平25。与RPA(T
13、4 UvsX)或RAA(大肠杆菌UvsX)中使用的重组酶不同26,MIRA使用螺旋酶(gp41)和重组酶(SC-recA)的组合来形成单链DNA并启动反应。多酶系统加速了反应速度,促进了对潜在抑制剂的耐受性。在MIRA中,核酸模板的扩增过程可以在3742下1030min内完成。这项技术已被用于检测猪瘟病毒25。与其他等温扩增类似,反转录-MIRA(RT-MIRA)产物也可以通过侧流条检测或实时定量PCR进行可视化检测。本研究开发了一种结合MIRA技术和CRISPR/Cas13a系统的MSRV核酸检测方法,该方法特异性强,灵敏度高并且操作简便,为MSRV的现场检测提供帮助,也为尽早发现MSRV采
14、取防控措施提供帮助。1 1 材料与方法 1.11.1 样本来源从鲈鱼养殖场采集患有大口黑鲈弹状病毒全长约2 cm的鱼苗样品,均存放于80冰箱保存。1.21.2 实验仪器与试剂主要试剂:纯化的LwaCas13a(East Mad东抗生物公司);Tris饱和酚(pH7.8);RNAiso plus和RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司);反转录试剂(TOYOBO东洋纺公司);T7高产RNA转录试剂盒、ChamQSYBR qPCR Master Mix(Without ROX)试剂盒(Vazyme诺唯赞生物技术有限公司);CRISPR/Cas13a检测系统的缓冲液使用Macklin麦克林试剂公司定制
15、(40 mmol/L Tris-HCl pH 7.3,60 mmol/L NaCl,6 mmol/L MgCl2);MIRA-RNA恒温快速扩增试剂盒(基础型)(潍坊安普未来生物科技有限公司)。主要仪器:Tannon2500 凝胶成像系统、实时荧光定量 PCR仪(美国Bio-Rad 公司);高速离心机(美国Beckman 公司);电泳仪(北京白晶生物技术有284水 生 生 物 学 报48 卷限公司);紫外透射器(美国MaestroGen公司)。1.31.3 crRNA的制备以及MIRA引物设计在GenBank中下载MSRV序列,针对其衣壳蛋白(CP)基因序列(NCBI:MK397811.2)设
16、计长度为20 nt的靶点,并根据靶点所在位置设计出两个crRNA(分别为crRNA1和crRNA2),如表 1所示,并通过NCBI-BLAST来确认其特异性。设计使用两对不同MIRA引物分别对含有靶序列的基因片段进行扩增,并命名分别为MIRA-F1/R1和MIRA-F2/R2,如表 2所示。1.41.4 MIRA扩增以及体外转录使用MIRA恒温快速扩增试剂盒,在42恒温条件下,用MIRA引物将提取出来的样品RNA进行扩增,并将扩增产物进行切胶回收,得到的DNA使用体外转录试剂盒体外转录为RNA,从而获得病毒RNA序列。1.51.5 标准品的制备基于实验室现有的cDNA库,用MSRV引物对cDN
17、A进行qPCR验证是否为MSRV。经测序确定后的模板cDNA经PCR扩增后进行体外转录,测定浓度并稀释得到RNA标准品。1.61.6 ssRNA报告探针合成ssRNA报告探针序列为:5-UUUUUU-3,5端和3端分别标记了荧光基团和淬灭基团。我们使用RNA酶来测试ssRNA报告探针作为检测信号的可行性,同时,利用Cas13a蛋白的特性,ssRNA报告探针可被激活的Cas13a蛋白裂解,从而发出荧光,可通过简单的紫外灯或荧光定量仪检测。1.71.7 Cas13a检测体系CRISPR/Cas13a检测反应体系如表 3所示,将反应物充分混匀离心后置于荧光定量仪上,选择观察 FAM 荧光强度,在37
18、恒温条件下反应1h,并且每隔1min收集一次荧光值,反应结束后用紫外灯照射观察荧光值。1.81.8 检测体系优化为了确定用CRISPR/Cas13a检测MSRV的最佳反应体系,我们对检测体系的四个部分进行了优化:crRNA种类、反应温度、ssRNA报告探针含量以及Cas13a与crRNA的反应浓度比,同时我们在实验中使用ddH2O作为空白对照。首先保持所有的参数不变,变量为crRNA的种类(即crRNA1和crRNA2),最后根据单位时间内反应效率及最终收集的荧光值来选择最佳的crRNA;探究最佳反应温度,除了反应温度,其他参数保持不变,分别在31、34、37和40进行实验;接下来,除了ssR
19、NA报告探针含量,其他参数保持不变,设置探针浓度分为100、200、300、400、500、600和700 nmol/L;最后,保持其他参数不变,改变Cas13a与crRNA的反应浓度比。根据单位时间内反应效率及最终收集的荧光值来选择最佳的反应温度、ssRNA报告探针浓度及Cas13a与crRNA的反应浓度比。1.91.9 灵敏度试验使用优化后的CRISPR/Cas13a检测系统检测不同浓度的RNA标准品,以104 fM到101 fM的浓度对RNA标准品进行10倍连续稀释,以无目标RNA样品为阴性对照,从而探寻CRISPR/Cas13a检测系统最低检测浓度。1.101.10 特异性试验使用优化
20、后的CRISPR/Cas13a检测系统检测不同的水产RNA病毒,包括RGNNV、BFNNV、TPNNV,用无病毒感染鱼的RNA作为阴性对照,用ddH2O作为空白对照,测试含有特异性crRNA的CRISPR/Cas13a检测系统是否能检测出其他的水产RNA病毒。1.111.11 重复性试验以及样品检验采集有明显患病迹象的病鱼样品,并对样品进行预处理和扩增RNA。采用本研究优化后的CRIS-表 1 针对MSRV设计的crRNA序列Tab.1 crRNA sequences designed for MSRV名称Name序列Sequence(53)crRNA1GACCACCCCAAAAAUGAAGG
21、GGACUAAAACCGAACUCUCAGUAAGCUGAGcrRNA2GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACGGACUGCCCUUCUUCCAUAG表 2 MIRA扩增引物序列Tab.2 Primer sequences for MIRA amplification名称Name序列Sequence(53)MIRA-F1TAATACGACTCACTATAGGGTCTGTGAGGTTGTCCMIRA-R1CCAACAACAGGATCACAAGGGCTTTGTCTTMIRA-F2TAATACGACTCACTATAGGGCAGATATCGTGGTCCMIRA-R2CCAACAA
22、CAGGATCACAAGGGCTTTGTCTT表 3 CRISPR/Cas13a检测体系Tab.3 CRISPR/Cas13a detection system组分Component体积Volume(L)Cas13a1crRNA1ssRNA报告探针1待测RNA样品/RNA标准品1反应缓冲液16合计Total202 期张敏琳等:基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法285PR/Cas13a检测系统,与实验室常规使用的MSRV检测方法(qPCR)做对比,以MSRV基因作为阳性对照组,无MSRV病毒感染鱼的RNA样品作为阴性对照组,ddH2O作为空白对照组。2 2 结果 2.
23、12.1 MIRA引物对筛选使用两对不同MIRA引物对含有靶序列的基因片段进行扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,如图 1a所示。电泳图位于100 bp的位置,3个泳道均出现明亮的条带,表明有非特异性扩增产物。泳道2和3中250 bp处为扩增的目的条带。用Image J软件分别将电泳图泳道2中长度为224 bp和泳道3中长度为255 bp的目的条带进行定量分析,并用“灰度值”表示定量分析的结果。从分析结果得出,灰度值越低表示引物利用率高,即引物特异性结合扩增效率高,如图 1b所示。结果表明:采用MIRA-F2/R2引物对时,特异性结合扩增效率高。2.22.2 CRISPR/Cas13a检测体系CR
24、ISPR/Cas13a检测体系反应结束后用紫外灯进行照射,观察荧光值(图 2)。2.32.3 CRISPR/Cas13a-MSRV最佳反应体系我们分别用RNA标准品和扩增的样品RNA进行实验,如图 3a所示,靶向目标RNA的定位速度,crRNA2要优于crRNA1;crRNA1比crRNA2有更强的最终荧光信号;crRNA1+crRNA2等比例混合使用能综合两者的优点,反应效率更好。探究反应温度对检测系统的影响,设置了31、34、37和41不同反应温度,如图 3b所示,CRISPR/Cas13a-MSRV检测体系最佳反应温度是37。探究ssRNA报告探针浓度对检测系统的影响,如图 3c所示,在
25、测试范围内,荧光强度与ssRNA报告探针浓度呈正相关,ssRNA报告探针浓度在 500700 nmol/L检测效果差异不大,考虑到现实经济问题,最佳的ssRNA报告探针浓度为500 nmol/L。为探究不同Cas13a与crRNA的反应浓度比对检测系统的影响,如图 3d所示,当以每份100 nmol/L比例的基础上,Cas13acrRNA的比例为41和31时,Cas13a达到饱和状态;当Cas13a数量一定时,荧光信号的强度并没有与crRNA数量的增加呈正相关。因此,Cas13a与crRNA比例为21时,CRISPR/Cas13a-MSRV检测系统能够获得最大的检测活性。2.42.4 灵敏度评
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