坏死性凋亡在眼科的研究进展及其抑制剂的临床应用.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17坏死性凋亡在眼科的研究进展及其抑制剂的临床应用颜鑫霖 李轩南开大学附属眼科医院(天津 300020)【摘要】坏死性凋亡是近十几年来细胞死亡领域的重大发现。目前在眼科领域,已经从角膜疾病、青光眼、视网膜疾病等方向发现了坏死性凋亡通路的激活。除了针对受体相互作用蛋白1(RIP1)靶点的Necrostatin-1(Nec-1)坏死性凋亡抑制剂之外,受体相互作用蛋白3(RIP3)抑制剂GSK2399872A(GSK872)和针对混合谱系激酶结构域样蛋白(MLK
2、L)靶点的新型抑制剂TC13172等药物在细胞死亡机制方面取得了重大突破。目前,坏死性凋亡抑制剂已经在眼科的多种疾病模型中证明了其保护作用。本文重点概述了坏死性凋亡的分子机制及其抑制剂在眼科中的研究成果,探讨坏死性凋亡作为眼科疾病治疗新靶点的潜力,并对其在眼科领域的进一步研究提出建议。【关键词】细胞死亡;坏死性凋亡;受体相互作用蛋白1/3;混合谱系激酶结构域样蛋白;Nec-1;角膜;青光眼;视网膜【中图分类号】R246.82Research progress of necroptosis in ophthalmology and clinical application of its inhi
3、bitors YAN Xinlin,LI Xuan.Tianjin Eye Hospital,Nankai University,Tianjin 300020,ChinaCorresponding author:LI Xuan Email:【Abstract】Necroptosis is a major discovery in the field of cell death in recent decades.At present,in the field of ophthalmology,the activation of necroptosis pathway has been foun
4、d from corneal diseases,glaucoma,retinal diseases and so on.In addition to Necrostatin-1(Nec-1),a necroptosis inhibitor targeting receptor-interacting protein1(RIP1),drugs such as GSK2399872A(GSK872),a receptor-interacting protein3(RIP3)inhibitor,and TC13172,a novel inhibitor targeting mixed lineage
5、 kinase domain-like protein(MLKL),have made major breakthroughs in cell death mechanisms.Currently in the field of ophthalmology,necroptosis inhibitors have demonstrated their protective effects in a variety of disease models.This article focuses on the molecular mechanism of necroptosis and the res
6、earch results of its inhibitors in ophthalmology,discusses the potential of necroptosis as a new target for the treatment of ophthalmic diseases,and puts forward suggestions for its further research in the field of ophthalmology.【Key words】cell death;necroptosis;receptor-interacting protein1/3;mixed
7、 lineage kinase domain-like protein;Necrostatin-1;cornea;glaucoma;retina坏死性凋亡也称程序性坏死,是程序性细胞死亡的另外一种主要方式。坏死性凋亡不同于凋亡,会发生质膜破裂,引起周围组织炎性反应。目前,对于坏死性凋亡的研究在很多学科中已经有了一定的进展,而在眼科学中的研究相对较少。本文将对在眼科学中已经有结论的研究以及其抑制剂的治疗进展和临床应用做一综述,旨在为今后眼科学中坏死性凋亡更进一步的研究提供参考。1坏死性凋亡机制及其抑制剂的研究进展1.1坏死性凋亡背景介绍程序性细胞死亡是生物体发育分化过程中普遍存在的,一种由基因决
8、定的主动有序的细胞死亡方式。其包括了胚胎发育、维持组织稳态以及宿主对病原体免疫防御的生物过程。从程序性细胞死亡的发生机制上来分类,其可分为凋亡、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡、自噬依赖性细胞死亡等。1988 年,LASTER 等1首先发现坏死性凋亡这一有别于凋亡以及坏死的新的死亡方式。2000 年,受体相互作用蛋白 1(receptor-interacting protein 1,RIP1)作为坏死性凋亡通路中的第一个核心信号分子被HOLLER等人综 述doi:10.3969/j.issn.1006-5725.2023.17.021基金项目:国家自然科学基金(编号:82171024);天津市科技计划
9、项目(编号:20JCYBJC01450)2271实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17发现。2005年,DEGTEREV 等人将这种非凋亡性的细胞死亡方式命名为坏死性凋亡。坏死性凋亡的特点主要包括在坏死过程中产生活性氧以及炎性因子,DNA降解,并且通常产生坏死小体(necrosome)。其形态学特征表现为细胞膜完整性结构受到较明显地破坏,染色质颗粒呈不连续可逆性凝结、为白色絮状,细胞器显著肿胀、内质网显著崩解,细胞体积可因局部肿胀而明显变细膨大,基因组和DNA均被细胞随机降解、电泳图谱可显
10、示细胞呈涂抹状。坏死形成的生化过程亦常同时涉及细胞局部炎症渗出等多种反应,并有的可长期持续并释放出大量细胞内容物,残余留存下来的细胞碎片则常能被人体外源巨噬细胞彻底吞噬2。目前,已经在人体多个系统的疾病中发现了坏死性凋亡的参与,包括神经系统(如阿尔茨海默症),心血管系统(心肌梗死),呼吸系统(急性呼吸窘迫综合征),眼部疾病(青光眼)等3。1.2坏死性凋亡的分子机制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)介导的坏死性凋亡是最经典的通路4。TNF 是一种重要的促炎细胞因子,参与介导多种人类的炎症性疾病以及退行性疾病。在这个通路中,泛素化和磷酸化过程起到了重要作用(图 1)
11、。当 TNF 与肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)结合后,可使 TNFR 结构发生改变,RIP1、肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TNFR-sociated death domain,TRADD)、TNFR 相关因子 2/5(TNFR-ass-ociated factor 2/5,TNFR2/5)、胞内凋亡蛋白抑制因子 1/2(cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2,cIAP1/2)、线性泛素链组装复合物(linear ubiquitin chain assembly complex,LUB
12、AC)、去泛素化酶(cylindromatosis,CYLD)等蛋白形成复合物I。在复合物 I 中,cIAPs 和 LUBAC 通过 K63 连接的泛素链以及线性泛素链促进了RIP1的泛素化,继而引起了 TAK 结 合 蛋 白 2/3(TAK1-binding protein 2/3,TAB2/3)的招募,促进了对转化生长因子激活激酶 1(transforming growth factor-activated kinase 1,TAK1)的激活,形成 TAK1-TAB2-TAB3 复合物,同时携带有核因子 B 关键调节基因(nuclear factor-B essential modulat
13、or,NEMO)的调节亚基的抑制 性蛋白激酶(inhibitor of B kinase,IKK)组成IKK/IKK/NEMO 复合物,激活 NF-B 信号通路使细胞存活。当NF-B受体的靶蛋白的表达过程被环己酰亚胺受体选择性抑制并阻断通路时,由TRADD、Fas 死亡结构域相关蛋白(Fas-associated protein via death domain,FADD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8,caspase8)所组成的复合物a激活,通过下游信号通路诱导非RIP1依赖性细胞凋亡。而当RIP1泛素化过程受到
14、抑制时,会导致由RIP1、FADD、caspase8 组成的复合物 IIb 形成,该复合物可通过激活 caspase8 的活性来激活 RIP1 依赖性细胞凋亡。当 caspase8 活性受到抑制后,RIP1 通过同型相互作用基序RHIM(图2)与RIP3相结合,并通过自磷酸化或互相磷酸化激活,该复合物为坏死性凋亡的核心执行复合体,构象上呈淀粉样。接着,由N端四螺旋束结构域(4HBD)和 C 端假激酶结构域所组成的混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)被 RIP3 激活,形成坏死复合物necrosome(复合物IIc
15、),MLKL上的 Thr357 和 Ser358 位点被磷酸化,转化为开放的活性构象,暴露了其四螺旋束结构域,从而促进了 MLKL 的寡聚,形成依赖二硫键的类淀粉样RIP1-RIP3-MLKL复合体。然后磷酸化的MLKL通过高尔基体-微管体-肌动蛋白机制移动到质膜,通过紧密连接蛋白形成孔隙或选择性地调节调节离子通道,使钙、钠、钾离子内流,细胞内外渗透压均发生明显改变,最后形成细胞膜的破裂变性而坏死5-7。图1TNF介导的坏死性凋亡信号通路图Fig.1TNF-mediated signaling pathways of necroptosis图2RIP1和RIP3的结构示意图Fig.2Domai
16、n structure of RIP1 and RIP32272实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17尽管 RIP1 是 TNF 介导的坏死性凋亡信号通路中的必要分子,但它并不是其他通路的必要条件,除了经典的TNF信号通路外,还存在由其他的信号通路介导坏死性细胞凋亡过程的发生。如当病毒感染或感知细胞内源性RNA后,Z-DNA结合蛋白(另一种含有 RHIM 的蛋白质)通过 RHIM 同源相互作用招募并磷酸化RIP3,激活的RIP3磷酸化MLKL从而引起坏死性凋亡8。该过程不需要RIP1的参与
17、。1.3坏死性凋亡抑制剂的治疗进展以及临床应用随着对坏死性凋亡研究的深入,其抑制剂的种类和机制也取得了一定进展。Necrostatin-1(Nec-1)是坏死性凋亡的经典抑制剂,其通过与死亡结构域受体相互作用,抑制了 RIP1 的自磷酸化,从而阻止RIP1-RIP3-MLKL的信号传导过程9。目前已经证实Nec-1在呼吸系统、消化系统、神经系统等领域可以通过阻断坏死性凋亡而展现出保护作用10。Nec-1也有其副作用,如脱靶效应以及半衰期短等弊端。目前,针对坏死性凋亡的其他药物也在不断研发。近年来,针对RIP3靶点的药物 GSK2399872A(GSK872)在眼科领域的研究中证明其对坏死性凋亡
18、的治疗作用。有研究11报道 GSK872可以在体内外的细胞兴奋性毒性模型中抑制视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的坏死性凋亡过程,同时抑制炎症小体激活,从而提供新的神经保护治疗方法。TC13172是MLKL的特异性抑制剂12,通过与MLKL的半胱氨酸共价结合,抑制MLKL的寡聚化,显著抑制MLKL向胞膜的移动。目前,针对RIP1位点的抑制剂在类风湿性关节炎、阿尔茨海默症等疾病正处于期或期临床研究中13,RIP1抑制剂在患者中的临床试验仍处于早期阶段。迄今为止,具有适当体内活性的RIP1抑制剂已经开发出来。而开发具有选择性、强效性和更安全性的RIP1小分子抑制
19、剂,寻找能可靠测量其临床疗效的生物标志物仍然是未来临床发展面临的挑战。在眼科领域,坏死性凋亡抑制剂的相关研究也证明其对眼部坏死性凋亡相关疾病的保护作用。随着对坏死性凋亡抑制剂在临床的不断探索,可抑制靶点也不断被发现。今后研究可以针对不同治疗靶点的结合以及寻找新的特异性更强的靶点,从而使坏死性凋亡的治疗形成体系。由于目前眼科尚未有针对坏死性凋亡靶点相关的临床实验,因此,应借鉴其他领域已经在临床实验中所取得的成果,从而开展坏死性凋亡相关眼科疾病的临床研究。接下来,对眼科领域已取得的坏死性凋亡研究成果做一总结,为今后临床研究做为参考。2坏死性凋亡在眼科的研究进展2.1坏死性凋亡在角膜疾病的研究进展角
20、膜常直接与外界接触,容易受到损伤和感染,因此角膜疾病尤为多见,是致盲的重要眼病之一。各种原因产生的物理、化学、生物损伤都会引起角膜的水肿、混浊、溃疡、穿孔、新生血管,导致角膜的屈光改变和透明性下降。尽管目前临床上有药物以及手术的治疗方案应对各种类型的角膜疾病,但是很多角膜疾病的预后都会导致视力不可逆的下降,因此,对角膜疾病机制的了解将有助于开发新的治疗靶点。在感染性角膜炎中,坏死性凋亡的作用已被证实。医疗器械,如隐形眼镜,可以使细菌直接接触人体角膜上皮细胞。BROTHERS等14报道在细胞溶解素诱导角膜上皮细胞坏死性凋亡的模型中,奇异变形杆菌和粘质沙雷氏菌的ShlA家族细胞溶解素介导上皮细胞孔
21、隙产生,从而激活坏死性凋亡过程,而气泡产生和细胞死亡的过程可以被 RIP1 和 MLKL 抑制剂阻断。在细菌性角膜炎情况下,该病理过程可以迅速通过角膜上皮而侵入角膜基质,而细菌在角膜基质中更容易增殖,因此,将坏死性凋亡过程限制在角膜上皮中可以减轻组织损伤以及角膜炎的严重程度。而 GUO等15人报道,在 HSV-1 型感染性角膜炎小鼠模型中,caspase8以及RIP3基因双敲小鼠角膜感染7 d后收集的泪膜均含有感染性病毒,比野生型动物泪膜中观察到的感染率明显升高。同时12%的野生型小鼠出现脑炎并死亡,而50%的RIP3缺陷小鼠以及78%的caspas8以及RIP3基因双敲小鼠出现脑炎并死亡。表
22、明外源性凋亡和坏死性凋亡有助于HSV1急性感染期间对脑炎的抵抗。RIP3介导的坏死性凋亡通路抑制了病毒在角膜层面的复制,从而对单纯疱疹病毒性角膜炎起到了保护作用。上述研究结果表明,坏死性凋亡参与了部分感染性角膜炎的病程,而其在不同种疾病中起到不同的作用,如何调控坏死性凋亡在感染性角膜炎中的发展过程也是今后研究的方向之一。坏死性凋亡在角膜新生血管性疾病中也扮演着重要角色。RIP1在炎症细胞中表达升高,在调节细胞凋亡、坏死性凋亡以及炎症中发挥重要作用。在血管生成过程中,浸润的巨噬细胞中RIP1表达增加。使用 RIP1 基因缺陷的小鼠或抑制剂Nec-1进行干预,可减弱激光、基质栓塞和碱损伤诱导的小鼠
23、角膜新生血管生成16。表明RIP1激酶抑制可介导caspase通路激活,使浸润的巨噬细胞2273实用医学杂志 2023年第39卷第17期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.17增多,随即减轻病理性血管生成过程,提示了RIP1激酶的抑制在病理性血管生成中具有治疗作用。而RIP1是坏死性凋亡通路中的重要一步,其在坏死性凋亡与眼部新生血管性疾病之间的联系还需进一步研究。干眼与坏死性凋亡之间也存在着密切联系。最近研究认为,基于免疫的炎症反应、细胞凋亡等是干眼症发生发展的相关因素。眼表是眼睛结构的最外层,经常暴露在环境空气中。这使得它特别容
24、易受到外部空气污染物(如PM颗粒)的影响17。SHI 等18在体内以及体外实验中发现 PM颗粒通过坏死性凋亡可以诱导角膜炎症,减少粘蛋白的产生而导致眼表损伤引起干眼症。Nec-1通过抑制坏死性凋亡,可以显著减轻PM诱导的眼表损伤、炎症和粘蛋白分泌不足。这表明PM可以通过角膜炎症以及减少粘蛋白的产生介导坏死性凋亡引起干眼症,而Nec-1具有预防以及治疗PM暴露相关的干眼症的潜力。干眼症的病因还包括睑板腺功能异常、水液层泪腺泪液分泌不足等原因,这些病理过程是否存在坏死性凋亡的参与还需进一步研究验证。外用滴眼液对于治疗眼科疾病至关重要,但是在其临床浓度的使用中也会引起角膜细胞的坏死性凋亡产生而带来副
25、作用。近年来,对于药物所致的坏死性凋亡的研究也有了一定的进展。YOU等19通过体外和体内模型发现10%苯肾上腺素可引起兔角膜上皮细胞的破坏和凋亡。10%1.25%苯肾上腺素通过RIP1-RIP3-MLKL级联反应引起人角膜上皮细胞坏死性凋亡,0.625%苯肾上腺素通过线粒体依赖和死亡受体介导的信号通路诱导角膜上皮细胞凋亡。可见同一信号通路的上游元素在不同浓度刺激条件下可以诱导出不同的细胞死亡方式。JIANG 等20发现高浓度(0.5%和0.25%)噻吗洛尔可以诱导兔角膜缘干细胞发生坏死性凋亡。因此,研究滴眼液对于角膜上皮的毒性及其作用机制,对制定安全有效的临床用药策略具有重要意义。但是降低药物
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