酶活性测定方法及酶学分析类型.ppt

职业教育医学检验技术专业教学资源库生物化学检验酶活性测定方法及酶学分析类型酶活性测定方法及酶学分析类型 酶酶学学分分析析是是20世世纪纪70年年代代发发展展起起来来的的一一类类检检测测技技术术，包包括括酶酶活活性性测测定定和和底底物物浓浓度度测测定定两两大大类类型型。酶酶活活性性的的测测定定方方法法包包括括终终点点法法和和连连续续监测法。监测法。一、酶活性的测定方法一、酶活性的测定方法按照按照对酶对酶促反应时促反应时间的选择间的选择不同不同 连续监测法连续监测法 固定时间法固定时间法（一）固定时间法（一）固定时间法n分类：分类：终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。终点法：在反应进行到预定时间后要终止反应。两点法：该方法反应时间的预定是从两点法：该方法反应时间的预定是从t t1 1t t2 2 。n定义：定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。或产物的增加量。n特点：特点：优点优点是简单是简单。缺点缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。n注意：注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30306060分钟分钟为宜。为宜。（二）连续监测法（二）连续监测法n2 2、原理：、原理：n1 1、定义：、定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。该方法每隔一定时间（该方法每隔一定时间（10s10s60s60s）测定一次底物或产）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。，绘制反应速度曲线。n3 3、特点：、特点：在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法 缺点：缺点：要求高，要求能够精确地控制温度、要求高，要求能够精确地控制温度、pHpH值和底物浓度等反值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求。优点优点:能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。4、连续监测法的种类 1.直接连续监测法要求底物或产物能够直接测定 2.间接连续监测法 间接法又分为一步间接法和酶偶联法。酶偶联法指在原来的反应体系中再加入一些酶试剂，使加入的酶促反应和被测酶的酶促反应偶联起来。最后的反应产物可直接监测，进而推测出第一个酶的活性浓度。5、酶活性浓度的计算摩尔消光系数()的定义为在特定条件下，光径为1.00cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00 mol/L时的吸光度。如用连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(A/min)，以U/L表示酶活性浓度时，则按下式进行计算：式中：式中：V反应体系体积反应体系体积(ml)-摩尔消光系数摩尔消光系数(cm2mol-1)v样本量样本量(ml)L比色杯光径比色杯光径(cm)A吸光度变化吸光度变化 106为换算系数，将为换算系数，将mol换算成换算成 mol 此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！