黄芪甲苷对高糖环境下脂肪干细胞衰老的延缓作用.pdf
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1、Chinese Journal of Clinical Medicine,2023,Vol.30,No.3 中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期460论 著DOI:10.12025/j.issn.1008-6358.2023.20230192收稿日期 2023-02-14 接受日期 2023-04-06基金项目 上海市卫生健康委员会科研课题(20214Y0144),上海市金山区卫生和计划生育委员会课题(JSKJ-KTZY-2019-02),上海市第六人民医院金山分院第五周期重点学科,上海市名老中医学术经验研究工作室(SHGZS-202237).Supported by Scienti
2、fic Research Project of Shanghai Municipal Health Commission(20214Y0144),Project of Jinshan District Health and Family Planning Commission of Shanghai(JSKJ-KTZY-2019-02),the Key Discipline of the Fifth Cycle of Jinshan Branch of Shanghai Sixth Peoples Hospital,and Shanghai Famous Old TCM Academic Ex
3、perience Research Studio(SHGZS-202237).作者简介 高俊丽,硕士,主治医师.E-mail:*通信作者(Corresponding authors).Tel:021-57310206,E-mail:,黄芪甲苷对高糖环境下脂肪干细胞衰老的延缓作用高俊丽1,徐 静1,余春丽1,刘 琨1*,王巍巍2*,许国雄31.上海市第六人民医院金山分院肾内科,上海 2015002.海军特色医学中心肾脏科,上海 2012033 3.复旦大学附属金山医院临床医学研究中心,上海 200032引用本文 高俊丽,徐 静,余春丽,等.黄芪甲苷对高糖环境下脂肪干细胞衰老的延缓作用 J.中国临
4、床医学,2023,30(3):460-467.GAO J L,XU J,YU C L,et al.Effect of astragaloside alleviating senescence of adipose-derived stem cells under high-glucose environmentJ.Chin J Clin Med,2023,30(3):460-467.摘要 目的 探讨黄芪甲苷(astragaloside,Ast)减缓高糖环境下人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)衰老的作用。方法 通过用含不同浓度葡萄
5、糖的培养基培养 hADSCs,筛选出最适高葡萄糖浓度;用不同浓度的 Ast 干预高糖环境下的 hADSCs,筛选出最适 Ast干预浓度。将 hADSCs 分为 4 组:对照组用含 5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养;甘露醇组用含 5.5 mmol/L 葡萄糖和 19.5 mmol/L 甘露醇的培养基培养;高糖组用含最适高浓度葡萄糖的培养基培养;Ast组用含最适高浓度葡萄糖和最适浓度Ast的培养基培养。4组均培养72 h,通过SA-Gal染色观察细胞衰老,Annexin-FITC/PI 检测凋亡;qRT-PCR及 Western 印迹检测hADSCs 中p16、Pink1、Parkin、LC
6、3(LC3/)及p62 的表达情况;透射电镜观察线粒体及自噬小体情况。结果 最适高葡萄糖浓度为 25 mmol/L,最适 Ast 干预浓度为 20 mg/L。Annexin -FITC/PI 检测显示,与对照组比较,高糖组 hADSCs 凋亡增加(P0.001);与高糖组比较,Ast 组 hADSCs 凋亡减少(P0.001)。SA-Gal 染色显示,与对照组比较,高糖组衰老细胞增加(P0.001);与高糖组比较,Ast 组衰老细胞减少(P0.001)。qRT-PCR及Western 印迹显示:与对照组比较,高糖组hADSCs中p16 及p62 表达增加(P0.001),LC3、Pink1 及
7、 Parkin 表达减少(P0.001);与高糖组比较,Ast 组 hADSCs 中 p16 及 p62 表达减少(P0.001),LC3、Pink1 及 Parkin 表达增加(P0.01)。透射电镜下发现,高糖组线粒体肿胀变形、体积较大,自噬小体较少,Ast 组线粒体肿胀变形减轻、体积较小,可见大量自噬小体。结论 Ast可减缓高糖引起的hADSCs衰老,可能与其上调线粒体自噬有关。关键词 人脂肪源性干细胞;黄芪甲苷;高糖;衰老;自噬小体中图分类号 R 285.5文献标志码 AEffect of astragaloside alleviating senescence of adipose-
8、derived stem cells under high-glucose environmentGAO Jun-li1,XU Jing1,YU Chun-li1,LIU Kun1*,WANG Wei-wei2*,XU Guo-xiong3 1.Department of Nephrology,Jinshan Branch,Shanghai Sixth Peoples Hospital,Shanghai 201500,China2.Department of Nephrology,Navy Characteristic Medical Center,Shanghai 2012033,China
9、3.Clinical Medical Research Center,Jinshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China Abstract Objective To investigate the effect of astragaloside (Ast)alleviating human adipose-derived stem cells(hADSCs)senescence induced by high glucose.Methods The high glucose concentration was screened by
10、culturing hADSCs with glucose at different concentrations.The optimal Ast concentration was screened by culturing hADSCs with Ast at different concentrations.hADSCs were divided into four groups:the control group was treated with medium containing 5.5 mmol/L glucose;the mannitol group was treated wi
11、th medium containing 5.5 mmol/L glucose and 19.5 mmol/L mannitol;the high glucose group was treated with medium containing glucose at optimal high-concentration;and the Ast group was treated with medium containing 中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期 Chinese Journal of Clinical Medicine,2023,Vol.30,No.3461间 充 质
12、干 细 胞(mesenchymal stem cells,MSCs)起源于中胚层,可从脂肪、骨髓和脐带等组织中分离出来。MSCs 具有自我更新、多向分化、免疫原性低及成瘤风险小的优点,是干细胞治疗的安全来源,可用于血液系统疾病、自身免疫性疾病、肺部感染、糖尿病肾病等的治疗1-2。目前应用MSCs治疗疾病的临床研究均需体外大量扩增MSCs。但 MSCs 在体外不断扩增过程中会逐渐衰老,且在移植到体内后,复杂内环境(如高糖)会使其衰老加速、增殖变慢,从而影响疗效3。MSCs 衰老主要表现为细胞增大或呈颗粒形态,增殖和分化能力不足,SA-Gal活性升高。细胞衰老是一个复杂且不可逆的过程,与氧化应激、
13、DNA 损伤、端粒缩短、致癌基因激活及线粒体功能受损4密切相关。衰老严重影响干细胞多向分化能力,增加其突变风险,严重制约疗效。自噬及动力学维持是线粒体质量控制和维持细胞能量平衡的重要因素。线粒体受损积累及自噬抑制均可诱导细胞衰老损伤5。黄芪甲苷(astragaloside,Ast)和黄芪总苷能延缓氢化可的松诱导的衰老前期大鼠衰老进程,可能与两者参与抗氧化和调节免疫有关6。Ast 可通过调控氧糖剥夺再灌注模型离体神经干细胞中低氧诱导因子 1 与血管内皮生长因子表达,提高其增殖与分化能力,进而修复受损神经7。Ast 可Ast at optimal concentration and glucose
14、 at optimal high-concentration.After 72 hours of culture,SA-Gal staining was used to observe cell senescence;Annexin-FITC/PI was used to detect apoptosis;qRT-PCR and Western blotting were used to detect the expressions of p16,Pink1,Parkin,LC3(LC3/),and p62 in hADSCs;and transmission electron microsc
15、opy was used to observe mitochondria and autophagosomes.Results The optimal high glucose concentration was 25 mmol/L and the optimal Ast concentration was 20 mg/L.Annexin-FITC/PI showed that the apoptosis of hADSCs in the high glucose group was increased compared with the control group(P0.001),and t
16、he apoptosis of hADSCs in the Ast group was decreased compared with the high glucose group(P0.001).SA-Gal staining showed that the senescent cells increased in the high glucose group compared with the control group(P0.001),and the senescent cells decreased in the Ast group compared with the high glu
17、cose group(P0.001).qRT-PCR and Western blotting showed that compared with the control group,the expression levels of p16 and p62 in hADSCs in the high glucose group were higher(P0.001),and the expression levels of LC3,Pink1,and Parkin were lower(P0.001);compared with the high glucose group,the expre
18、ssion levels of p16 and p62 in hADSCs in Ast group were lower(P0.001),and the expression levels of LC3,Pink1,and Parkin were higher(P0.01).Transmission electron microscopy showed that the mitochondria in the high glucose group were swollen and deformed,with a large volume and a small number of autop
19、hagosomes;after Ast intervention,a small number of swollen and deformed mitochondria were observed,with a large number of autophagosomes.Conclusions Ast could alleviate hADSCs senescence induced by high glucose,and the mechanism may be related to the up-regulation of mitophagy.Key Words human adipos
20、e-derived stem cells;astragaloside;high glucose;senescence;autophagosome抑制造血干细胞的衰老,促进造血干细胞增殖8。本课题组前期研究9发现,人脂肪源性干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)移植可改善糖尿病肾病大鼠蛋白尿,从而延缓其肾脏病进展,且经 Ast 干预后疗效更显著,但具体机制尚不清楚。因此,本文通过体外细胞实验,模拟糖尿病肾病宿主体内的高糖环境,从线粒体自噬角度探讨 Ast 对高糖环境下 hADSCs 衰老的延缓作用,为后续 Ast 提高干细胞疗效相关研究提供基础。
21、1 材料与方法 1.1 实验材料及仪器 hADSCs 购自美国 ATCC公司。Ast 购自中国药品生物制品检定所。其他试剂 包 括 hADSC 培 养 液(GIBCO,10567-014)、成人脂肪间充质干细胞专用胎牛血清(GIBCO,12664-025)、胰 酶(Cyagen)、CCK8 试 剂 盒(Dojindo),p16(Abcam,ab189034)、帕 金森 蛋 白(Parkin;Invitrogen,PA1-751)、同 源性磷酸酶-张力蛋白诱导激酶 1(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,Pink1;
22、Proteintech,23274-1-AP)、微管相关蛋白轻链 3(LC3;Cell Signaling Technology,3868s)、p62(Cell Signaling Technology,23214s)抗体。仪器包括正置光学显微镜(尼康,ECLIPSE CI)、酶标仪(上海科华,ST-360)、qRT-PCR 仪(ABI,Chinese Journal of Clinical Medicine,2023,Vol.30,No.3 中国临床医学 2023年6月 第30卷 第3期4627900HT)、医用 X 射线暗匣广东粤华,5 in7 in(1 in2.54 cm)、激 光 扫
23、描 仪(EPSON,Perfection V39)、透射电镜(HITACHI,HT7800或 HT7700)。实验于 2020 年 6 月至 2021 年 12月在复旦大学附属金山医院临床试验中心完成。1.2 葡萄糖与 Ast干预浓度选择1.2.1 葡萄糖浓度 取生长状态良好的 hADSCs,以每孔 3 000 个细胞接种于 96 孔板,培养基中分别加入 5.5、15、20、25、30、35 mmol/L 葡萄糖(n3),用 10%FBS于 37、5%CO2 培养箱中培养 24 h、48 h、72 h、96 h。通过CCK8 法检测各时间点细胞增殖情况,选择最适高葡萄糖浓度。1.2.2 Ast
24、 浓度 取生长状态良好的 hADSCs,以每孔 3 000 个细胞接种于 96 孔板,分别加入 10、20、30、40 mg/L Ast(以 20 g/L储存于DMSO中)及 19.5 mmol/L 甘 露 醇(n3),用 10%FBS 于37、5%CO2 培养箱中培养 24 h、48 h、72 h。通过CCK8 法检测各时间点细胞增殖情况,选择最适Ast干预浓度。1.3 细胞培养、干预及活性检测 选取第 35 代hADSCs 进行实验,随机分为 4 组:对照组给予含5.5 mmol/L葡萄糖的培养液培养;甘露醇组予含5.5 mmol/L 葡萄糖19.5 mmol/L 甘露醇的培养液培养;高糖
25、组予含最适高浓度葡萄糖的培养液培养;Ast组予含最适高浓度葡萄糖+最适浓度 Ast培养。4 组均培养 72 h 后消化收集 hADSCs。采用 CCK8法(试剂盒购自Dojindo)检测hADSCs增殖能力;用 SA-Gal 染色法(试剂盒购自 Beyotime)检测hADSCs 衰老情况;采用 Annexin -FITC/PI(试剂盒购自 BD)检测 hADSCs 凋亡情况。1.4 qRT-PCR 检测线粒体自噬相关基因表达 取第 35 代 hADSCs,以每孔 1.26105个细胞接种于 6 孔板(分组同上)。TRIzol 法提取细胞总 RNA,按照反转录试剂盒操作步骤反转录为cDNA,引
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