第五章分子生物学研究方法.ppt

第五章第五章分子生物学研究方法分子生物学研究方法5.1重组重组DNA技术发展史技术发展史5.2DNA操作技术操作技术5.3基因克隆技术基因克隆技术5.4基因表达研究技术基因表达研究技术5.5蛋白质组学及研究技术蛋白质组学及研究技术.5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史4040年代明确了遗传的物质基础是年代明确了遗传的物质基础是DNA DNA 5050年代揭示了年代揭示了DNA DNA 分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题传递问题 。5050年代末和年代末和6060年代提出了年代提出了“中心法则中心法则”和操纵和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。了遗传信息的流向和表达问题。5.1.1重组重组DNADNA技术诞生的理论基础技术诞生的理论基础.5.1.25.1.2关键性实验技术问世为重组关键性实验技术问世为重组DNADNA技术奠基技术奠基 1 1、DNADNA分子的切割与连接技术分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收噬菌体的DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3 3、SouthernSouthern杂交、杂交、DNADNA序列分析和聚合酶链反应序列分析和聚合酶链反应 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.重组重组DNADNA技术技术(recombinant DNA technique):recombinant DNA technique):是是按照人们意愿，在体外对按照人们意愿，在体外对DNADNA分子进行重组分子进行重组,再将再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该殖，以获得该DNADNA的大量拷贝的大量拷贝。基因克隆基因克隆(gene cloning)gene cloning)分子克隆分子克隆(molecular cloning)molecular cloning)5.1.35.1.3重组重组DNADNA技术的概念技术的概念5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.5.1.4 5.1.4 重组重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 1 1、四大要素、四大要素 外源基因外源基因 载体载体 工具酶工具酶 受体细胞受体细胞 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.2 2、重组、重组DNADNA技术的基本步骤技术的基本步骤 目的基因的获得与载体的制备目的基因的获得与载体的制备目的基因与载体目的基因与载体DNADNA的连接的连接重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞重组体的筛选与重组重组体的筛选与重组DNADNA的鉴定的鉴定克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化 5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNAcDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNADNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.5.1.55.1.5重组重组DNADNA技术的意义技术的意义 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意义。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.酶类酶类功能功能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中双链中的缺口的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端末端末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团5.1.65.1.6重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)(restriction endonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶 分类分类:、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）5.15.1、重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d属属系系株株序序Haemophilusinfluenzaed株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)即反相重复结构，是 DNA分子中以某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.DNADNA连接酶连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片片断连接成一个整体断连接成一个整体DNADNA分子。分子。T T4 4DNADNA连接酶连接酶EcoREcoR I I 连接酶连接酶T T7 7DNADNA连接酶连接酶5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.目的基因的来源目的基因的来源n原核细胞n真核细胞：cDNA或gDNA文库n人工合成及PCR扩增目的基因 天然DNA（染色体DNA、病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA）5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.（八）重组实验中的主要载体（八）重组实验中的主要载体定义：定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分分子。子。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计的载体称为克隆载体。计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多多肽链而特意设计的载体称为表达载体。肽链而特意设计的载体称为表达载体。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.载体的选择标准载体的选择标准能自主复制能自主复制；具有两个以上的具有两个以上的遗传标记遗传标记物，便于重组体的筛选和物，便于重组体的筛选和鉴定；鉴定；有克隆位点有克隆位点（外源（外源DNADNA插入点），常具有多个单一插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；酶切位点，称为多克隆位点；分子量小分子量小，以容纳较大的外源以容纳较大的外源DNADNA。5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.n噬菌体载体：噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5端突出粘性末端 噬菌体噬菌体黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC：高容量载体高容量载体5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.个克隆载体所容纳的外原个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小片段的大小n质粒：质粒：10kbn噬菌体：噬菌体：23kbn黏粒：黏粒：45kbnBAC：350kbnYAC：1000kb5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.以以质质粒粒为为载载体体的的DNA克克隆隆过过程程5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史技术发展史.5.2.1细菌转化细菌转化5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术转化转化（transformation）：P151P151感受态细胞（感受态细胞（Competent cells）：受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状转导？转导？转染？转染？.常用的转化方法：n化学转化（CaCl2）法n电击法5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.化学转化原理：化学转化原理：在在0冷冻处理时，处于冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。复原并增殖，表达外源基因。5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.P1535.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.电击转化：电击转化：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。菌液：生长对数期场强(最大转化效率)：12.5-15kV/cm 温度：0-4 5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.克隆的筛选：克隆的筛选：n抗生素基因。抗生素基因。n常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等霉素、四环素、链霉素等n-互补蓝白斑筛选互补蓝白斑筛选n营养条件（自养、异养）营养条件（自养、异养）5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.-互补筛选互补筛选5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术n-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒n编码-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞nIPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑.蓝白斑筛选LacZ,IPTGX-galX+gal（白色）（白色）（蓝色）（蓝色）LacZ（失活）（失活）,IPTGX-galX-gal（白色）（白色）（白色）（白色）5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.蓝白斑蓝白斑5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.转化率的计算：转化率的计算：n转化体总数菌落数转化体总数菌落数（转化反应原液总体积（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）涂板菌液体积）n插入频率白色菌落数插入频率白色菌落数/蓝色菌落数蓝色菌落数+白色菌白色菌落数落数n转化频率转化体总数转化频率转化体总数/加入质粒加入质粒DNA的量的量（计算出每微克的转化菌落数）（计算出每微克的转化菌落数）5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2.2聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术n1985年，K.Mullis等研究成功的一种在体外快速扩增特定基因DNA序列的方法n原理原理：类似于天然的DNA复制过程。将待扩增的DNA片段和两侧互补的两段寡核苷酸引物，经过变性，退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n 倍5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.反应体系反应体系n模板模板DNA：待扩增的目的片段n特异性引物：特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bpnDNA聚合酶聚合酶ndNTPn含有含有Mg2+的缓冲液的缓冲液5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.PCRPCR的基本反应步骤：的基本反应步骤：1.1.变性变性：95 95，模板，模板DNADNA变性为单链；变性为单链；2.2.退火退火：5050左右，使引物与模板左右，使引物与模板DNADNA退火结合；退火结合；3.3.延伸延伸：72 72，DNADNA聚合酶以聚合酶以dNTPdNTP为底物催化为底物催化 DNA DNA的合成反应。的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经上述三个步骤为一个循环，经25-3025-30次循次循 环后，可将模板环后，可将模板DNADNA扩增达百万倍。扩增达百万倍。5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.PCR技术在基因克隆方面的应用技术在基因克隆方面的应用 n（1）目的基因的直接克隆，）目的基因的直接克隆，n（2）通过）通过RT-PCR进行进行cDNA的克隆；的克隆；n（3）制备）制备DNA探针，进行分子检测等。探针，进行分子检测等。5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2.3cDNA文库文库ncDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.构建步骤：n1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素P156 2、反转录生成cDNA:反转录酶，olig(dt),R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.文库中筛选目的基因DNADNA探针探针：带有：带有特殊碱基序列特殊碱基序列的单链的单链DNADNA或或RNARNA分子分子,可以可以用放射性物质用放射性物质或免疫性物质或免疫性物质标记标记,通过杂交通过杂交,DNA,DNA探针探针常用常用于检测互补的于检测互补的碱基序列。碱基序列。5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2.3SNP技术应用技术应用n（singlenucleotidepolymorphism）单核）单核苷酸多态性，指基因组苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性单个核苷酸的突变而引起的多态性n一个一个SNP表示在基因组某个位点上有一表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换个核苷酸的变化，源于单个碱基的转换或颠换或颠换n应用：遗传病研究、动植物遗传育种应用：遗传病研究、动植物遗传育种5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.2.4基因敲除技术（基因敲除技术（geneknock-out）n通过一定的途径使特定的基因失活或缺通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用是应用DNA同源重组原理，用同源片段同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，进行精确的定位修饰替代靶基因片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同染色体一起稳定遗传和基因改造，同染色体一起稳定遗传二、常见的二、常见的DNA操作技术操作技术.n完全基因敲除完全基因敲除n条件型基因敲除条件型基因敲除n植物基因敲除株系筛选（植物基因敲除株系筛选（T-DNA插入失插入失活）活）5.2 常见的常见的DNA操作技术操作技术.5.3基因克隆技术简介基因克隆技术简介5.3.1RACE(rapidamplificationofcDNAends)一种通过一种通过PCRPCR进行进行cDNAcDNA末端快速克隆的技术，是末端快速克隆的技术，是以以mRNAmRNA为模板反转录成为模板反转录成cDNAcDNA第一链后用第一链后用PCRPCR技术技术扩增出某个特异位点到扩增出某个特异位点到3 3或或5 5 端之间未知序列端之间未知序列的方法。的方法。.mRNAmRNA的获取的获取去磷酸化去磷酸化加寡聚接头（加寡聚接头（55）反转录合成第一条反转录合成第一条cDNA cDNA 5 5 RACE RACE，扩增，扩增5 5未知未知序列序列3RACE3RACE扩增扩增3 3未知序列未知序列5 5 已知的接头序列；已知的接头序列；基因特异反向序列基因特异反向序列3 3 寡聚寡聚dTdT下游序列；下游序列；基因特异反向序列基因特异反向序列5.3基因克隆技术简介基因克隆技术简介.5.3.1cDNA差示分析法差示分析法(cDNA-RDA法法)n差减杂交与差减杂交与RT-PCR方法相结合，通过降方法相结合，通过降低低cDNA群体复杂性和更换群体复杂性和更换cDNA两端接两端接头等方法，特异扩增目的基因片段头等方法，特异扩增目的基因片段5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.5.3.2酵母双杂交体系酵母双杂交体系（Yeasttow-hybridsystem）基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。的研究蛋白质之间关系的技术。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子反式转录激活因子 GAL4GAL4：DNADNA结合功能域结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)DNA binding domain,DNA-BD)转录激活结构域（转录激活结构域（activation domainactivation domain，DNA-DNA-ADAD）被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的才能重新呈现完整的GAL4GAL4转录因子活性，并可激活上游转录因子活性，并可激活上游激活序列（激活序列（upstream activating sequence,UASupstream activating sequence,UAS）的的下游启动子，使下游基因得到转录。下游启动子，使下游基因得到转录。5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.n主要实验过程：主要实验过程：a.选择缺失选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株编码基因的酵母寄主菌株b.研究的猎物研究的猎物(或称靶蛋白或称靶蛋白)蛋白的基因与编码蛋白的基因与编码AD的的序列结合序列结合c.诱饵诱饵(bait)蛋白的基因与编码蛋白的基因与编码BD的序列结合的序列结合,形成形成两段融合基因两段融合基因d.将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录）表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录）的阳性菌落。的阳性菌落。5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.酵母双杂交系统的应用：酵母双杂交系统的应用：n发现新蛋白和蛋白的新功能发现新蛋白和蛋白的新功能n研究抗原和抗体的作用（细胞内）研究抗原和抗体的作用（细胞内）n筛选药物的作用位点筛选药物的作用位点n建立基因组蛋白连锁图建立基因组蛋白连锁图5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.n19861986年提出，根据目的基因在染色体上的位置进行的，年提出，根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的无需预先知道基因的DNADNA顺序，也无需预先知道其表达产物顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但必须建立遗传分离群体的有关信息，但必须建立遗传分离群体n主要用于与遗传病相关基因等致病基因的克隆主要用于与遗传病相关基因等致病基因的克隆5.3.4 5.3.4 基因的图位克隆法基因的图位克隆法 （Map-based cloningMap-based cloning）5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.1 1、将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并、将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的在其两侧确定紧密连锁的RFLPRFLP或或RAPDRAPD分子标记分子标记2 2、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来的基因片段克隆并分离出来3 3、鉴定目的基因、鉴定目的基因步骤步骤:5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.n染色体步移：染色体步移：利用已知的基因或分子标记来筛选大片段的DNA文库获得阳性克隆，如此得到的阳性克隆是“一步克隆”，利用获得的克隆作探针对文库进行第二次杂交，得到与探针具有重复序列的阳性克隆称为“二次克隆”，如此反复即可取到需要要得克隆，获得目的基因。5.3 基因克隆技术简介基因克隆技术简介.5.4基因表达研究技术基因表达研究技术5.4.1基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术5.4.2RNA选择性剪切机制选择性剪切机制5.4.3原位杂交技术原位杂交技术5.4.4定点突变技术定点突变技术5.4.5RNAi技术技术P171-180.n蛋白质组学蛋白质组学：蛋白质和基因组研究相结合，：蛋白质和基因组研究相结合，研究某一物种、个体、器官、组织、或细胞研究某一物种、个体、器官、组织、或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。图谱。5.5 蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术.n（一）、双向电泳技术（一）、双向电泳技术n（二）、质谱技术（二）、质谱技术n（三）、蛋白质免疫印迹实验（三）、蛋白质免疫印迹实验n（四）、凝胶阻滞实验（四）、凝胶阻滞实验（EMSA）n（五）、噬菌体展示技术（五）、噬菌体展示技术n（六）、免疫共沉淀技术（六）、免疫共沉淀技术n（七）、蛋白质磷酸化分析（七）、蛋白质磷酸化分析P183191.