华南热带水库拟柱孢藻产毒基因型的低优势及影响因子分析——以珠海市水库为例.pdf
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1、doi:10.7541/2023.2023.0072华南热带水库拟柱孢藻产毒基因型的低优势及影响因子分析以珠海市水库为例吴孟李1 范利青1 吴艳龙1 秦 伟1 商添雄2 程 楠3 雷腊梅3(1.珠海市供水与排水治污中心,珠海 519000;2.珠海市水资源中心,珠海 519000;3.暨南大学生命科学技术学院生态学系,广州 510632)摘要:研究以珠海市20座水库两次(2018年和2022年)调查数据为基础,分析华南热带地区产毒拟柱孢藻的发生规律和拟柱孢藻毒素(CYN)的健康风险。基于rpoC1和cyrJ基因的荧光定量PCR分析发现,在两次采样的40个样品中均检到拟柱孢藻,在其中的33个样品
2、中检到产毒拟柱孢藻。种群内产毒基因型的比例在0.046%38.66%,表明产毒株广泛存在但不占优势。与2018年相比,20座水库的总拟柱孢藻丰度均值在2022年增加近10倍,但两年的产毒拟柱孢藻丰度无显著差异;产毒基因型的比例明显下降,比例均值和最大值分别从2018年的14.86%和38.66%降至2022年的4.17%和17.24%;CYN浓度与产毒细胞比例具有类似的变化趋势,平均浓度也从0.56 降至0.19 g/L。线性混合效应模型分析表明,非产毒基因型丰度随无机磷的升高及硝氮的下降而显著增加,而产毒拟柱孢藻比例随水温升高而增加。关键词:产毒和非产毒拟柱孢藻;拟柱孢藻毒素;荧光定量PCR
3、;热带水库;环境因子中图分类号:S932.7 文献标识码:A 文章编号:1000-3207(2024)02-0211-11 拉氏拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii,简称拟柱孢藻CYL)被认为是热带特征性蓝藻,有学者建议将其与尖头藻合并,改称拉氏尖头藻(Raphi-diopsis raciborskii)1。拟柱孢藻所产生的拟柱孢藻毒素(CYN)是一类环胍类生物碱物质,具有肝毒性,神经毒性、繁殖毒性和细胞毒性,进入细胞后能抑制谷胱甘肽、细胞色素P450和蛋白质的合成,是一种潜在的致癌物,对人类健康造成严重危害2,3。澳大利亚最早对饮用水中CYN浓度进行限定,安
4、全限值为1 g/L3,美国在2016年也发布了CYN卫生警告水平,6岁以下人群为0.7 g/L,6岁以上则为3.0 g/L4,2022年WHO建议CYN的长期暴露浓度应不超过0.7 g/L。由此可见,CYN引起的水华毒性在国际上已广受关注。作为一种入侵蓝藻,拟柱孢藻已广泛扩张至加拿大、新西兰、欧洲各国等温带地区的水体,目前仅南极洲未出现拟柱孢藻的报道5,6。在我国,拟柱孢藻发现在广东、福建、云南、湖北、台湾、山东和北京等多个省份有分布711,并在台湾、福建、广东等地区形成优势和较高生物量7,11,12,尤其在地处热带-亚热带的广东省,拟柱孢藻已逐渐取代微囊藻成为多个水库的优势种群,在广东省江门
5、市镇海水库中常年优势度可达93.5%9,13。然而,在自然水体中同一蓝藻的产毒和非产毒基因型往往共存,两者通过显微观测无法区分14,15,基于毒素合成酶基因的PCR检测可鉴别两种基因型,而进一步发展的荧光定量PCR(qPCR)则可实现对水体中产毒和非产毒蓝藻的准确定量16,17。包括我国在内的世界上许多国家已将qPCR大量应用于湖泊、水库及河流中产毒微囊藻的分布动态及室内模拟研究15,16,18,19。相比较而言,尽管拟柱孢藻已广泛分布于全球,将qPCR用于产毒拟柱孢藻第 48 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报Vol.48,No.2 2024 年 2 月ACTA HYDROBIOLOGIC
6、A SINICAF e b.,2 0 2 4 收稿日期:2023-03-05;修订日期:2023-05-18基金项目:广东省自然科学基金(2023A1515012361);国家自然科学基金(31770507)资助 Supported by the Natural Science Foundation ofGuangdong Province(2023A1515012361);National Natural Science Foundation of China(31770507)作者简介:吴孟李(1969),男,本科,高级工程师;主要研究方向为生态环境监测。E-mail:通信作者:雷腊梅,E
7、-mail:The Author(s)2024.This is an open access article under the CC-BY 4.0 License(https:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/).监测的研究仅有几例14,2023,如我国澳门水库中产毒拟柱孢藻丰度与氨氮浓度显著正相关22,澳大利亚North Pine水库中开展的中宇宙试验则发现磷添加显著促进浮游植物群落中产毒拟柱孢藻的生长 14。初步研究表明环境因子在调节产毒和非产毒两种基因型的演替中起重要作用20,2223,但基于上述有限的研究难以弄清产毒基因型的发生规律。在我国,产
8、毒拟柱孢藻和CYN已在浙江、湖北、福建、安徽、广东、澳门等地区的水体被检测到8,21,22,24,25,Jiang等 8认为产CYN的拟柱孢藻在我国是呈零星分布的,非产毒拟柱孢藻的分布更为普遍。而基于Lei等 9的研究,CYN在广东省东莞市水库中广泛分布,检到的频次显著高于微囊藻毒素,浓度最高可达8.25 g/L,但该研究没有区分拟柱孢藻的产毒与非产毒种群。Lei等 21进一步建立了基于CYN毒素合成酶基因cyrJ的qPCR方法,发现广东省水库约74%的样品中可检到产毒拟柱孢藻,即产毒基因型在该地区广泛存在,但其在拟柱孢藻种群中并不占优势,最高比例不超过35%,而目前对产毒拟柱孢藻在我国热带地
9、区发生分布的影响因子还缺乏研究。本研究以位于华南热带地区的广东省珠海市20座水库为对象,对比分析2018和2022年水库中产毒拟柱孢藻丰度、比例和CYN浓度的变化,结合同步测定的环境因子,分析和了解产毒拟柱孢藻发生分布规律,为该地区防范拟柱孢藻水华的毒性风险和水质管理提供科学依据。1 1 材料与方法 1.11.1 采样点的布设与样品采集珠海市位于广东省南部,全市都属于热带地区(21482227 N 和 1130311419E;图 1)。20座水库主要分布在香洲区(7座)和斗门区(8座),高新区和高栏港区各2座,大镜山、竹银、乾务和凤凰山等4座水库为中型水库,其余16座为小型水库(表 1)。分别
10、在2018和2022年对20座水库进行采样,除了大镜山和蛇地坑水库的采样是在2018年的10月进行,其他水库的采样均在当年雨季结束后的78月进行,并在1周内完成所有水库的采样。在水库的出水口或大坝处设置1个监测点,2次共采集到40个样品。在水库监测点的表层0.5 m处使用有机玻璃采水器采集2 L水样,于2h内运至实验室,其中1 L用于理化指标测定,另外1 L水样取200 mL用0.45 m孔径滤膜过滤收集藻细胞用于DNA 提取,同时取2 mL水样用于测定总拟柱孢藻毒素和微囊藻毒素浓度,上述处理的样品未测定前直接冻存于20冰箱保存。1.21.2 理化指标分析NO3NH+4总氮(TN)、总磷(TP
11、)、硝态氮(-N)、铵态氮(-N)及无机磷(PO4-P)浓度按照国家水质标准GB3838-200测定,叶绿素a(Chl.a)含量采用水利部水质分析相关方法进行检测(SL88-1994)。YSI-多参数水质检测仪现场测定水温和pH,赛氏盘(Sec-!月坑潭井南山龙井乾务缯坑竹银南屏青年银坑梅溪白水寨木头冲茶冷迳先锋岭竹仙洞凤凰山大镜山西坑水陂珠海市020 km10广东省蛇地坑N图 1 珠海市20座调查水库的分布Fig.1 Location of twenty reservoirs in Zhuhai city212水 生 生 物 学 报48 卷chi Disk)测定透明度(SD)。参照广东省水库
12、的经验公式计算水库的营养状态指数(TSI)26,TSI50 为富营养型。1.31.3 荧光定量PCR分析水库浮游植物样品中的基因组DNA采用试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)提取,将收集到藻细胞的滤膜剪碎,加入800 L试剂盒中的裂解液,置于细胞破碎仪(Fastprep 24-5G)辅助裂解细胞,随后按照说明书进行DNA的提取,在分析前基因组DNA置于20冰箱保存备用。水样中的总拟柱孢藻丰度和产毒拟柱孢藻丰度的测定采用Lei等 21建立的荧光定量PCR(qPCR)方法,该方法针对拟柱孢藻rpoC1基因(RNA聚合酶亚基1)和cyrJ基因(CYN合成酶基因簇中的J基因)筛选获得特异性引物对和
13、探针(表 2)。以克隆有两个基因的质粒为标准品,利用质粒 DNA 为模板建立rpoC1和cyrJ基因的不同拷贝数与对应Ct值间的标准曲线,获得基因组拷贝数的对数与Ct值的线性方程,根据样品的Ct值算出其初始模板的浓度,计算获得水体中的拟柱孢藻总丰度(rpoC1基因拷贝数)和产毒拟柱孢藻丰度(cyrJ基因拷贝数),非产毒拟柱孢藻丰度为两者的差值,拟柱孢藻种群中产毒细胞比例为(cyrJ/rpoC1)100。荧光定量PCR反应体系如下:PCR反应液15.4 L,引物探针混合液2 L,Hot-start Taq酶1.2 L,DNA模板5 L,加纯水至50 L。PCR反应为热启动,反应条件:95,2mi
14、n,然后94 15s,55 45s,50个循环。1.41.4 拟柱孢藻毒素和微囊藻毒素分析水库水样反复冻融后超声处理1min,离心10min后留上清液用于拟柱孢藻毒素(CYN)和微囊藻毒素(MC)浓度的测定。MC的检测采用美国Beacon公司的微囊藻毒素检测试剂盒,该试剂盒是为直接竞争ELISA(酶联免疫吸附性分析)模式,在450 nm波长进行吸光值的测定后绘制标准曲线,获得线性模拟曲线和方程,并根据方程计算样品中MC浓度。CYN的检测亦为直接竞争ELISA方法,CYN单克隆抗体N8为Lei等27筛选制备,HRP-CYN采用文献28报道的连接方法,ELISA具体步骤如下:包被二抗的微孔板中依次
15、加入50 L的HRP-CYN、CYN标准品(0、0.1、1、5和10 ng/mL)或样品、CYN单抗N8,37振动孵育1h,洗涤液冲洗6次,加入显色剂100 L,室温孵育1030min,加入终止液后采用酶标仪测OD450nm的吸光值,绘制标准曲线并计算样品中CYN浓度。1.51.5 数据处理和分析在R软件采用程序包boxplot对2018和2022年的环境因子、总拟柱孢藻和产毒拟柱孢藻丰度、产毒细胞比例和CYN浓度进行箱须图的绘制,并采用One-way ANOVA进行显著性比较,显著水平为P0.05。对拟柱孢藻丰度、产毒藻比例、CYN浓度与环境因子进行Spearson相关分析并在P0.05);
16、水库的透明度整体在2018年更深,但2018和2022年间无显著差异(P0.05)。2018和2022年水库TP浓度分别在0.010.112和0.0050.05 mg/L,2018年20座水库的TP和NO3-N浓度均值均高于2022年,但统计分析表明两个年份间差异不显著(P0.05)。PO4-P是浓度呈显著增加的唯一理化因子(P0.01),2022年20座水库的均值为14.9 g/L,比2018年高3.4倍。与2018年相比,水库的TN和NH4-N浓度在2022年显著下降(P0.05)。根据TSI指数,两次调查时珠海市水库整体为中营养状态,2018和2022年间的TSI均值无显著差异(P0.0
17、5);茶冷迳水库为唯一的贫营养水库,但其TSI从2018年的29.3上升到2022年38.3,2022年TSI50的水库为6座(大镜山、梅溪、竹银、先锋岭、木头冲和白水寨),稍高于2018年的4座(大镜山、南屏、竹银和竹仙洞)。2.22.2 水库中的总拟柱孢藻、产毒拟柱孢藻丰度和比例在两次调查期间,基于rpoC1和cyrJ基因的荧光定量PCR方法在20座水库的40个样品中均检到拟柱孢藻,在其中33个样品中检到产毒拟柱孢藻,2018和2022年未检到产毒基因型的样品分别为3个(大镜山、青年和茶泠迳)和4个(银坑、乾务、西坑水陂和先锋岭),表明这些水库中只存在非产毒基2018202200.51.0
18、1.52.02.53.03.5年Year*SD(m)201820222426283032年YearT()201820226789年YearpH20182022010203040506070年YearChl.a(g/L)20182022303540455055年YearTSI201820221234年YearTN(mg/L)201820220.020.040.060.080.10年YearTP(mg/L)2018202200.0050.0100.0150.0200.0250.0300.035年YearPO4-P(mg/L)2018202200.050.100.150.200.250.300.35
19、年YearNH4-N(mg/L)2018202200.51.01.52.0年YearNO3-N(mg/L)图 2 2018年和2022年20座水库理化因子变化范围的比较Fig.2 Comparison of variabilities on environmental variables of twenty reservoirs between 2018 and 2022*和*分别表示显著水平P0.05和P0.01,下同*and*represent significant level at P0.05 and P0.01,the same applies below214水 生 生 物 学 报
20、48 卷因型或产毒基因型丰度低至无法检出。2018和2022年20座水库的拟柱孢藻总丰度分别在2.031045.71108 和4.791052.3109 cells/L(图 3A),产毒拟柱孢藻丰度分别在1.331032.18108和5.261031.14108 cells/L(图 3B),种群内产毒基因型的比例(cyrJ/rpoC1)在0.046%38.66%,最大值出现在2018年的龙井水库(图 3B),但20座水库中产毒基因型比例在2018和2022年均没有超过50%,表明非产毒基因型在拟柱孢藻种群内占据优势。2022年有17座水库总拟柱孢藻丰度较2018年明显增加,水库总丰度均值从20
21、18年的3.41107 cells/L上升至2022年的3.15108 cells/L,增长近10倍,两个年度间总拟柱孢藻丰度呈显著差异(图 3C;P0.05)。从2018年到2022年,非产毒基因型在拟柱孢藻种群内的优势进一步扩大,产毒基因型比例进一步显著降低(P0.05),其均值和最大值分别从2018年的14.86%和38.66%降至2022年的4.17%和17.24%(图 3B和3C)。2.32.3 拟柱孢藻毒素和微囊藻毒素浓度2018年水库样品仅测定了CYN浓度,仅大镜山水库未检到CYN,其他19座水库中CYN浓度范围在0.191.58 g/L(图 4A),最高浓度出现在乾务水库。20
22、22年同时检测了CYN和MC,20座水库中有6座水库(梅溪、银坑、乾务、龙井、凤凰山和先锋岭水库)中未检到CYN,其他14座水库中CYN浓度在0.10.767 g/L(图 4A);MC仅在竹银和先锋岭两座水库中检到,浓度分别为0.192和0.103 ng/mL。2018年有4座水库(银坑、乾务、龙井和南山)的CYN浓度超过WHO建议的0.7 g/L的安全限值,而2022年仅月坑水库的CYN浓度超过安全限值(图 4A)。与2018年相比,16座水库的CYN浓度在2022年出现明显下降,2018年水库的CYN浓度均值(0.56 g/L)显著高于2022年(0.19 g/L;图 4B;P0.05)。
23、2.42.4 产毒拟柱孢藻丰度和比例、拟柱孢藻毒素浓度与环境因子的关系Spearson相关分析表明(表 3),总拟柱孢藻丰度和产毒基因型丰度与pH(P0.001),Chl.a(P0.05)和 TSI(P0.05)呈显著正相关;此外,总拟柱孢藻丰度还与PO4-P(P0.05)显著正相关,与NO3-N(P0.05)显著负相关。种群中产毒拟柱孢藻的比例则与TN和 NH4-N都呈显著正相关(P0.05)。CYN浓度分别与水温(P0.01)和NH4-N(P0.05)显著正相关;此外,线性回归分析表明CYN与与总拟柱孢藻丰度无明显关系,与产毒细胞比例均呈极显著正相关(图 5B;R2=0.459;n=40;
24、P0.001),与产毒细胞丰度呈显著相关(图 5A;R2=0.133;n=40;P0.05),用“step”函数筛选后得到线性模型,结果显示PO4-P和NO3-N是总拟柱孢藻和非产毒拟柱孢藻丰度的显著解释变量(表 4),两者丰度的对数值均随PO4-P浓度的升高而增加,随NO3-N浓度的降低而减少(图 6)。混合效应模型分析表明水温(T)对产毒细胞比例有显著影响(coef.est=2.01;coef.se=0.83;df=37;P=0.02)。3 3 讨论与微囊藻易聚集形成表面水华不同,拟柱孢藻在水柱中的垂直分布较为均匀,特别是在中小型水库中几乎没有空间差异22,因此很多研究均采取表层浮游植物样
25、品进行观测1113,20。本研究采用前期建立的基于rpoC1和cyrJ基因的qPCR方法对珠海市20座水库表层0.5 m的样品进行定量分析21,结果发现在2018年和2022年两次调查的40个样品中均检到拟柱孢藻,其中33个样品检到产毒拟柱孢藻,表明该类水华蓝藻已在广东省水库广泛分布9,29,产毒拟柱孢藻的发生也极为普遍21,30。从两次调查的结果可知,种群内产毒基因型的比例最高为38.66%,这与我们前期在广东省的观测结果一致21,30,即非产毒基因型在拟柱孢藻种群内占据优势。从2018到2022年,拟柱孢藻总丰度均值增长了近十倍,这意味着我国热带水库中拟柱孢藻的水华强度在明显增加。然而种群
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