黄芪甲苷调控外泌体介导的JMJD3_H3K27me3_OPN通路抗结直肠癌肝转移机制研究.pdf

上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 黄芪甲苷调控外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN通路抗结直肠癌肝转移机制研究李玲，季青，周晶上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科/肿瘤研究室（上海 201203）【摘要】目的研究黄芪甲苷（AS）抑制结直肠癌肝转移的作用机制，探索AS对外泌体介导的Jumonji结构域包含蛋白3（JMJD3）/第27位的赖氨酸三甲基化的组蛋白H3（H3K27me3）/骨桥蛋白（OPN）信号通路的影响。方法取对数生长期的MC38细胞，超速离心法提取MC38细胞外泌体（MC38-EVs）及AS干预后MC38细胞外泌体（AS/MC38-EVs），粒径鉴定后用于动物实验。选取C57BL/6J小鼠15只，建立结直肠癌原位肝转移模型后，按照随机数字表法分为模型组、MC38-EVs组、AS/MC38-EVs组，每组5只。模型组造模前1周尾静脉注射磷酸盐缓冲液（PBS），100 L/次，隔日1次，连续3周；MC38-EVs组和AS/MC38-EVs组造模前1周尾静脉分别注射0.1 g/L的MC38-EVs、AS/MC38-EVs，100 L/次，隔日1次，连续3周。4周后处死小鼠，观察结直肠癌肝转移情况；苏木精-伊红（HE）染色法观察肝转移灶病理学改变；蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达情况；免疫荧光法检测肝转移灶中F4/80+、CD206+巨噬细胞的浸润和JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达；实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测瘤体中JMJD3、OPN mRNA表达。结果与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显增加（P0.05）；与MC38-EVs组比较，AS/MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显减少（P0.05）；免疫荧光结果显示，与模型组比较，MC38-EVs组中肝组织F4/80+、CD206+巨噬细胞浸润程度明显升高（P0.05）；与 MC38-EVs 组比较，AS/MC38-EVs 组中肝组织巨噬细胞浸润程度明显降低（P0.05）；Western blot、RT-qPCR和免疫荧光结果显示，与模型组比较，MC38-EVs组JMJD3、OPN蛋白和mRNA表达水平明显升高（P0.05），H3K27me3蛋白表达水平明显降低（P0.05）；与MC38-EVs组相比，AS/MC38-EVs组JMJD3、OPN蛋白和mRNA表达水平明显降低（P0.05），H3K27me3蛋白表达水平明显升高（P0.05）。结论AS能够有效抑制结直肠癌肝转移，其机制与调控外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN通路激活相关。【关键词】结直肠癌；肿瘤转移；黄芪甲苷；外泌体；肿瘤相关巨噬细胞；中药；药理作用Mechanism of Astragaloside regulates extracellular vesiclesmediated JMJD3/H3K27me3/OPN pathway against colorectal cancer liver metastasisLI Ling，JI Qing，ZHOU JingDepartment of Medical Oncology&Cancer Institute of Integrative Medicine，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，ChinaAbstract：ObjectiveTo explore the mechanism of Astragaloside （AS）in inhibiting colorectal cancer liver metastasis and to investigate the effect of AS on extracellular vesicle-mediated Jumonji domain-containing protein-3（JMJD3）/trimethylated histone H3 at lysine 27（H3K27me3）/osteopontin（OPN）signaling pathway.Methods MC38 cells at the logarithmic growth stage were taken，and MC38 cell extracellular vesicles（MC38-EVs）and MC38 cell extracellular vesicles after AS intervention（AS/MC38-EVs）were extracted by ultracentrifugation，and the particle size was identified and used for animal experiments.After establishing the orthotopic liver metastasis model of colorectal cancer，fifteen C57BL/6J mice were randomly divided into model group，MC38-EVs group and AS/MC38-EVs group，with 5 animals in each group.The model group was injected with PBS in the tail vein 1 week before modeling，100 L per time，every other day for 3 weeks；the MC38-EVs group and the AS/MC38-EVs group were injected with 0.1 g/L，100 L per time MC38-EVs and AS/MC38-EVs in the tail vein 1 DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2308044实 验 研 究基金项目 国家自然科学基金项目（82274297，82074225）；中国博士后基金面上项目（2022M722159）；上海市炎癌转化病证生物学前沿研究基地项目（2021KJ03-12）作者简介 李玲，女，硕士研究生，主要从事中西医结合防治消化道肿瘤的临床研究工作通信作者 季青，研究员，博士研究生导师；E-mail：。周晶，博士后；E-mail：42上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 week before modeling respectively，every other day for 3 weeks.The mice were executed after 4 weeks to observe the liver metastases of colorectal cancer；HE staining was performed to observe the pathological changes of liver metastases；Western blot was performed to detect the expression of JMJD3，H3K27me3 and OPN in liver metastases；immunofluorescence was performed to detect the infiltration of F4/80+，CD206+macrophages and the expression of JMJD3，H3K27me3，and OPN in liver metastases；RT-qPCR detected JMJD3，OPN mRNA expression in the tumor.ResultsThe number of metastases and weight of liver were significantly higher in the MC38-EVs group compared with the model group（P0.05），while those were significantly lower in the AS/MC38-EVs group compared with the MC38-EVs group（P0.05）；the immunofluorescence results showed that the extent of F4/80+，CD206+macrophage infiltration in liver tissue was significantly higher in the MC38-EVs group compared with the model group（P0.05），but that was significantly lower in the AS/MC38-EVs group compared with the MC38-EVs group（P0.05）；Western blot，RT-qPCR and immunofluorescence results showed that the expression levels of JMJD3 and OPN proteins and mRNA were significantly higher（P0.05）and H3K27me3 protein expression level was significantly lower（P0.05）in the MC38-EVs group compared with the model group.Compared with the MC38-EVs group，JMJD3 and OPN protein and the mRNA expression levels were significantly lower（P0.05）and H3K27me3 protein expression level was significantly higher（P98%），上海源叶生物科技有限公司（批号：B20564）；Dulbecco 改良的 Eagle（DMEM）培养基、0.25%的胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液，美国Corning公司（批号分别为10-013-CV、25-053-CI、30-002-CI）；胎牛血清，美国 Gibico 公司（批号：10099-141）；乙二胺（Cy3）标记山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG，H+L）、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG（H+L）、免疫染色封闭液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）、蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号分别为 A0516、A0423、P0102、A0208、P0010）；凝胶快速制备试剂盒，上海雅酶生物医药科技有限公司（批号：PG212）；预染彩虹蛋白标记，美国Thermo Fisher Scientific公司（批号：26616）；化学发光液，德国 Merck Millipore公司（批号：WBKLS0500）；RNA提取试剂盒、43上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 逆转录试剂盒、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司（批 号 分 别 为 RC112、R312、Q331）；抗 体 JMJD3、H3K27me3、OPN及成熟小鼠巨噬细胞标志物（F4/80）、甘露糖受体（CD206）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），美 国 CST 公 司（批 号 分 别 为 457S、9733T、88742S、30325T、24595S、92310SF）。1.1.4主要仪器双人垂直流超净工作台，新加坡 ESCO 公司（型号：SVE-6A1）；台式低速离心机，德国 Eppendorf 公司（型号：5702R）；PCR 仪，美国 Thermo Fisher Scientific公司（型号：7500）；激光扫描共聚焦显微镜，德国Leica公司（型号：Leica SP-8）；微型超速离心机，日本Hitachi株式会社（型号：CS120FNX）；纳米颗粒跟踪分析仪，英国Malvern公司（型号：NS300）；恒温恒湿细胞培养箱，美国 Thermo Fisher Scientific 公司（型号：51033575）；化学发光成像仪，上海勤翔科技有限公司（型号：Chemiscope 6000）；酶标仪，美国 Biotek 公司（型号：Synergy H1）；电泳仪及转膜仪，美国Bio-Rad公司（型号分别为Power Pac HV、Trans-blot SD）；组织研磨仪，上海净信实业发展有限公司（型号：Tissuelyser-96）。1.2细胞实验1.2.1细胞培养及药物干预MC38 细胞接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。待细胞铺满培养瓶90%时以0.25%胰蛋白酶消化后传代，传代比例1 3，传至第3代后用于正式实验。实验组为对照组、AS组。对照组常规培养。基于课题组前期研究12基础，AS组以25 mol/L AS加入DMEM培养基配置成条件培养基继续培养。培养48 h后分别收集细胞培养上清至50 mL离心管，-80 保存。所有细胞均培养于5%CO2、37、50%70%饱和湿度细胞培养箱中。1.2.2外泌体提取采用差速离心法提取外泌体。从-80 冰箱中取出收集的细胞培养上清，4 解冻后离心。4、800 r/min离心10 min，取上清，去除细胞及碎片；4、4 000 r/min离心 10 min，取上清；0.22 m滤器过滤后，4、240 000 r/min离心 30 min，取上清；将离心后上清转移至超离管内，4、240 000 r/min超速离心 70 min，弃上清，加入适量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀；4、240 000 r/min超速离心 70 min，弃上清，沉淀即为外泌体。加入适量 PBS 重悬外泌体，-80 保存备用。使用前采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。对照组细胞培养上清提取的外泌体命名为MC38-EVs，AS组细胞培养上清提取的外泌体命名为AS/MC38-EVs。1.2.3外泌体鉴定取10 L外泌体悬液，稀释10倍后采用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径大小及浓度。1.3动物实验1.3.1分组与造模C57BL/6J小鼠15只，按照随机数字表法分为模型组、MC38-EVs组、AS/MC38-EVs组，每组5只。参考Lin等14造模方法，构建小鼠结直肠癌原位肝转移模型，以皮下移植瘤作为瘤源，将肿瘤组织放置在无菌质量分数为0.9%的氯化钠溶液中，剔除出血及坏死组织，分割成若干直径约 1 mm 大小的组织块备用。1%戊巴比妥50 mg/kg腹腔内注射麻醉。取下腹正中切口，长约 1 cm，逐层切开皮肤、腹膜，进入腹腔，钳出盲肠，于盲肠末端用眼科剪轻轻划破浆膜面，用医用胶将瘤体粘到盲肠末端，将盲肠回纳入腹腔，逐层关腹。小鼠结直肠癌原位肝转移模型构建方法见图1。1.3.2干预方法模型组，每只小鼠尾静脉注射PBS，100 L/次，隔日 1 次，造模前 1 周开始，连续 3 周。MC38-EVs 组，每只小鼠尾静脉注射 0.1 g/L 的 MC38-EVs，100 L/次，隔日1次，造模前1周开始，连续3周。AS/MC38-EVs 组，每只小鼠尾静脉注射 0.1 g/L 的AS/MC38-EVs，100 L/次，隔日 1 次，造模前 1 周开始，连续3周。1.4检测指标与方法1.4.1肝转移灶数目小鼠结直肠癌原位肝转移模型构建4周后，剥取小鼠肝脏组织，观察肝转移灶数目并记录。1.4.2肝转移灶病理学变化采用苏木精-伊红（HE）染色法观察肝转移灶病理学变化。取小鼠肝转移灶并置于4%多聚甲醛中固定15 min，100%、95%、85%、75%乙醇中依次梯度脱水3 min。二甲苯透明后常规浸蜡图1小鼠结直肠癌原位肝转移模型构建44上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 包埋；固定于切片机，切成58 m厚度的薄片。苏木精水溶液染色5 min，流水冲洗后，酸水及氨水各分色30 s，流水浸泡返蓝 5 min，70%及 90%乙醇脱水10 min，伊红染色 5 min，流水冲洗后，无水乙醇脱水2 min，二甲苯透明5 min。透明后的切片快速风干，加拿大树胶封片，镜检。1.4.3蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达各组小鼠分别切取20 mg 的转移瘤组织置于 1.5 mL EP 管中，每管加入300 L蛋白裂解液，置于组织研磨仪中研磨匀浆。冰上裂解10 min后，4、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，得到肝转移瘤组织蛋白。BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。聚丙烯酰胺蛋白电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温 下 封 闭 2 h，相 应 一 抗 JMJD3、H3K27me3、OPN、GAPDH 均以1 1 000稀释，4 孵育过夜，Tris缓冲液洗涤后，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗杂交，比例1 5 000。等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤后，ECL发光液浸泡 1 min 后 显 影。ImageJ 软 件 检 测 每 组 JMJD3、H3K27me3、OPN、GAPDH灰度值，以GAPDH为内参，每组相对表达量以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值计算。1.4.4免疫荧光法检测肝转移灶中 F4/80、CD206、JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达取小鼠肝转移灶，常规脱水包埋后，冰冻切片10 m，切片置于0.1 mol/L枸橼酸液中进行抗原修复；山羊血清室温封闭1 h，PBS清洗后，加入相应一抗稀释液（比例1 500），4 孵育过夜；PBS清洗后，荧光二抗室温避光孵育1 h；PBS清洗后，4,6-二脒基-2苯基吲哚避光孵育15 min；PBS清洗后滴加抗荧光淬灭剂封片。全自动数字玻片扫描仪扫片，ImageJ 软件分析平均荧光强度，检测肝转移灶中相关蛋白表达。1.4.5RT-qPCR法检测肝转移灶中JMJD3、OPN mRNA表达各组小鼠分别切取 10 mg的转移瘤组织，加入350 L 裂解液，冰上匀浆至无明显组织团块。按照RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将 RNA 逆转录为 cDNA，按 RT-qPCR 试剂盒说明书进行mRNA荧光定量。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，引物序列见表 1。以GAPDH为内参基因，采用 2-Ct法分析各组相关mRNA表达水平。1.5统计学方法采用 GraphPad Prism 9.0、SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析与作图。计量资料以x s表示。实验数据进行正态性和方差齐性检验，若数据符合正态分布，多组间差异比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间差异比较采用LSD检验；不符合正态分布或方差不齐的数据，其多组间差异比较采用Kruskal-Wallis 检验，两组间差异比较采用Games-Howell 检验。以P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1对结直肠癌肝转移灶的影响通过分离小鼠肝脏，观察肝脏转移情况，进行肝转移灶计数和肝脏称重，并对肝脏进行HE染色。结果显示，与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显增加（P0.05）；与MC38-EVs组比较，AS/MC38-EVs组肝转移灶数目和肝脏质量明显减少（P0.05）。见图2、图3、表2。2.2对肿瘤相关巨噬细胞 F4/80、CD206 蛋白的影响与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶中F4/80+、CD206+巨噬细胞数目明显增多（P0.05）。与 MC38-EVs组比较，AS/MC38-EVs组肝转移灶中F4/80+、CD206+巨噬细胞数目明显减少（P0.05）。见图4。2.3对肿瘤相关巨噬细胞 OPN蛋白的影响与模型组比较，MC38-EVs 组肝转移灶中 OPN 表达显著升高（P0.05）。与MC38-EVs组比较，AS/MC38-EVs组肝转移灶中OPN 表达显著降低（P0.05）。见图5。2.4对 JMJD3/H3K27me3/OPN 通路的影响Western 表1引物序列基因GAPDHJMJD3OPN引物序列上游：5-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3下游：5-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3上游：5-GGCTCTTTGATTTCCCACCCACTC-3下游：5-TGCTGCTGCTCCTCCTCCTTC-3上游：5-ACGATGATGATGACGATGGAGACC-3下游：5-CGACTGTAGGGACGATTGGAGTG-3引物长度/bp232724212423注：GAPDH为甘油醛3磷酸脱氢酶基因，JMJD3为Jumonji结构域包含蛋白3基因，OPN为骨桥蛋白基因。注：黄色箭头为结直肠癌肝转移灶。图2各组小鼠结直肠癌肝转移灶解剖图45上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 blot、免疫荧光实验结果显示：与模型组比较，MC38-EVs 组肝转移灶中 JMJD3、OPN 蛋白表达水平升高，H3K27me3 蛋白表达水平降低（P0.05）；与 MC38-EVs组比较，AS/MC38-EVs组肝转移灶JMJD3、OPN 蛋白表达水平降低，H3K27me3 蛋白表达水平升高（P0.05）。注：A为苏木精-伊红染色（10），B为苏木精-伊红染色（40）。图3各组小鼠肝转移灶形态结构比较表2各组小鼠肝转移灶数目和质量比较（n=5，x s）组别模型组MC38-EVs组AS/MC38-EVs组肝转移灶数目/个3.800.8312.402.70*4.600.89#肝脏质量/mg944.7474.341 443.80277.84*793.08125.30#注：与模型组比较，*P0.05；与MC38EVs组比较，#P0.05。注：Merge为目标分子染色与核染色合成图，CD206为甘露糖受体，F4/80为成熟小鼠巨噬细胞标志物，DAPI为细胞核染色图。A为模型组，B为MC38-EVs组，C为AS/MC38-EVs组。图4各组肝转移灶中CD206、F4/80蛋白表达水平比较（免疫荧光染色，200）46上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 见表3、图6、图7。RT-qPCR实验结果显示，与模型组比较，MC38-EVs组肝转移灶中 JMJD3、OPN mRNA 表达水平升高（P0.05）；与MC38-EVs组比较，AS/MC38-EVs组肝转移灶JMJD3、OPN mRNA表达水平降低，（P0.05）。见表4。3讨论手术切除肝转移灶是结直肠癌肝转移的主要治疗方式，也是最有效的治疗手段。但临床证据表明，仅不到25%的患者达到手术切除指征，并且手术后遗症、药物不良反应等问题严重影响患者的生存质量14。在防治结直肠癌复发转移中，中西医结合治疗模式展现出显著优势。研究15-19显示，中医药在“整体观念”和“治未病”的理论指导下，可有效改善手术、放射治疗、化学疗法、靶向治疗和免疫治疗引起的不良反应，延长患者生存时间。中医认为正气亏虚是结直肠癌发生的根本原因，也是结直肠癌转移的基础。黄芪作为经典扶正药材，有补中益气、健脾利水之功，广泛应用于肿瘤治疗。经现代药理学研究20证实，黄芪主要通过提升患者的免疫功能从而发挥抗肿瘤作用。AS是黄芪的主要单体活性物质，也是评价黄芪发挥药效的物质基础。AS具有抗炎、抗癌、抗氧化、调节免疫和调节代谢等多方面的药理作用20-22。研究23-26发现，AS在抗癌方面具有较大潜力，且抑癌效果广谱，对胃癌、肝癌、结直肠癌、宫颈癌等多种癌症具有抑制作用。体内动物实验研究27表明，AS直接灌胃给药能剂量依赖性抑制结直肠癌的生长和转移。与顺铂联用可显著增强结直肠癌的化学疗法敏感性 28。本研究证实，AS能够通过调控肿瘤外泌体抑制结直肠癌肝转移。H3K27me3是一种基因沉默性表观遗传学标记，影响基因的转录与翻译，与肿瘤的发生发展显著相关。JMJD3是一种组蛋白去甲基化酶，属于Jumonji C结构注：Merge为目标分子染色与核染色合成图，OPN为骨桥蛋白，DAPI为细胞核染色图。A为模型组，B为MC38-EVs组，C为AS/MC38-EVs组。图5各组肝转移灶中OPN蛋白表达水平比较（免疫荧光染色，150）表3各组肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白表达水平比较（n=5，x s）组别模型组MC38-EVs组AS/MC38-EVs组JMJD3/GAPDH1.000.001.420.07*0.740.14#H3K27me3/GAPDH1.000.000.490.05*1.320.16#OPN/GAPDH1.000.001.560.10*1.230.10#注：GAPDH为甘油醛3磷酸脱氢酶，JMJD3为Jumonji结构域包含蛋白3，H3K27me3为第27位的赖氨酸三甲基化的组蛋白H3，OPN为骨桥蛋白。与模型组比较，*P0.05；与MC38EVs组比较，#P0.05。注：GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，JMJD3为Jumonji结构域包含蛋白3，H3K27me3为第27位的赖氨酸三甲基化的组蛋白H3，OPN为骨桥蛋白。A为模型组，B为MC38-EVs组，C为AS/MC38-EVs组。图6各组肝转移灶中JMJD3、H3K27me3、OPN蛋白电泳条带图47上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第11 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.11，Nov.2023 域包含基因家族，通常在结直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤等癌症中高表达，与不良预后相关29。JMJD3通过以序列特异性的方式对H3K27me3进行去甲基化，影响染色质松紧结构，进而解除转录抑制，使其成为转录激活蛋白3。研究30发现，结直肠癌中，JMJD3通过解除H3K27me3对E-钙黏蛋白、紧密连接蛋白-1和紧密连接蛋白-7等基因的转录抑制，促进结直肠癌发展。同时，JMJD3与巨噬细胞激活关系密切，其具体机制在于活化的JMJD3通过促进H3K27me3去甲基化促进精氨酸酶1、白介素-10、抵抗素样等相关基因的表达，促进巨噬细胞M2表型改变31。本研究证实，JMJD3能够通过H3K27me3 影响 OPN 活性调控巨噬细胞表型，AS能够调控JMJD3介导的H3K27me3/OPN通路。OPN是一种新发现的肿瘤相关巨噬细胞标记物，在结直肠癌的肝转移灶巨噬细胞中显著高表达4，然而有关巨噬细胞中OPN表达水平具体的调控机制仍不清楚。本研究显示，肿瘤来源外泌体可以促进巨噬细胞JMJD3、OPN蛋白表达，抑制H3K27me3蛋白表达，提示JMJD3在结直肠癌转移前微环境的形成中充分发挥其去甲基化酶的作用，降低H3K27me3甲基化水平，促进OPN转录，使巨噬细胞向肿瘤相关巨噬细胞表型转变，即影响JMJD3/H3K27me3/OPN通路可能是肿瘤外泌体影响结直肠癌肝转移的重要机制。AS作用后，肝转移灶数目减少，巨噬细胞JMJD3、OPN蛋白表达显著降低，H3K27me3蛋白表达升高，提示AS抑制结直肠癌肝转移的机制与JMJD3/H3K27me3/OPN通路有关。综上所述，本研究发现AS能够抑制结直肠癌肝转移，减少肿瘤相关巨噬细胞激活。并结合体内实验进一步探讨了AS抗结直肠癌肝转移的作用机制，发现AS可能通过影响外泌体介导的JMJD3/H3K27me3/OPN信号通路减少肿瘤相关巨噬细胞激活，进而抑制结直肠癌肝转移，发挥抗肿瘤作用。本研究为阐明AS抗结直肠癌肝转移分子机制提供了重要的理论依据，也可为深入研究中药抗肿瘤的药理作用提供参考。参考文献：1 SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA Cancer J Clin，2021，71（3）：209-249.2 DAI J，SU Y，ZHONG S，et al.Exosomes：key players in cancer and potential therapeutic strategyJ.Signal Transduct Target Ther，2020，5（1）：145.3 PEREIRA F，BARBCHANO A，SILVA J，et al.KDM6B/JMJD3 histone demethylase is induced by vitamin D and 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