动物细胞培养的应用.ppt
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1、动物细胞培养的应用.表表1 动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等.表2 微生物和动物细胞培养方法的比
2、较微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时几天几天3、4周对水纯度的要求较低很高与与微生物细胞培养类似,动物细胞的体外培养有两种类型:微生物细胞培养类似,动物细胞的体外培养有两种类型:一类是非贴壁一类是非贴壁依赖性细胞,这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养;另一类是依赖性细胞,这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养;另一类是贴壁依赖性细胞,它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。贴壁依赖性细胞,它们
3、需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。.5、动物细胞大规模培养工艺、动物细胞大规模培养工艺大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养的的工工艺艺流流程程如如图图11-15所所示示。工工艺艺过过程程中中,先先将将组组织织切切成成碎碎片片,然然后后用用溶溶解解蛋蛋白白质质的的酶酶处处理理而而得得到到单单个个细细胞胞,再再用用离离心心法法收收集集细细胞胞。将将细细胞胞植植入入营营养养培培养养基基,使使细细胞胞在在培培养养基基中中增增殖殖到到覆覆盖盖瓶瓶壁壁表表面面,用用酶酶把把细细胞胞从从瓶瓶壁壁上上消消化化下下来来,再再接接种种到到若若干干培培养养瓶瓶中中进进行行扩扩大大培培养养,将将培培养养所
4、所得得的的细细胞胞“种种子子”冷冷藏藏于于液液氮氮中中,从从液液氮氮中中取取出出一一部部分分细细胞胞“种种子子”进进行行解解冻冻、复复活活培培养养,进进行行扩扩大大培培养养以以获获得得足足够够的的细细胞胞量量,将将细细胞胞接接种种于于大大规规模模生生物物反反应应器器中中进进行行大大规规模模培培养养,按按照照产产物物的的不不同同形形式式进进行行产产物物分分离离纯纯化化。对对于于积积累累在在细细胞胞内内的的产产物物,可可通通过过收收集集细细胞胞后后进进行行破破胞胞,再再经经过过分分离离纯纯化化获获得得产产物物;对对于于由由细细胞胞分分泌泌到到培培养养液液中中产产物物,可可以以通通过过浓浓缩缩、纯纯
5、化化培培养养液液来来获获得得产产品品;而而对对于于那那些些必必须须加加入入诱诱导导剂剂进进行行培培养养或或病病毒毒感感染染培培养养才才能能得得到到的的产产物物的的细细胞胞,可可加加入入上上述述诱诱导导剂剂诱诱导导或或病病毒毒感感染染后后,收收集集细胞,再经分离纯化得到产物。细胞,再经分离纯化得到产物。.图图11-15 大大规规模模动动物物细细胞胞培培养养工工艺艺流流程程图图细胞培养反应器细胞培养反应器提取提取细胞细胞诱生剂诱生剂细胞细胞产品(肿瘤抗原)产品(肿瘤抗原)纯化纯化产品(干扰素)产品(干扰素)纯化纯化提取提取产品(单克隆抗体)产品(单克隆抗体)浓缩纯化浓缩纯化79865432110.
6、内容(一)内容(一)单克隆抗体单克隆抗体哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害,其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白,这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合,并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白,就是抗体;相对于抗体,诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的,它们存在于人和脊椎动物的血清之中,是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性,可以识别各种不同的抗原,还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原,因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋
7、白质工程和转基因技术等技术的发展,抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。.抗体抗体由B细胞产生的免疫球蛋白,它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。抗原抗原指诱导产生抗体的物质。如前所述,抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分,因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原,同时可激活宿主的防卫系统。对于一个免疫刺激(有毒物质或病原物侵入,即抗原),每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体,这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域,也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇,因此每
8、个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体,这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。有毒物质或病原物侵入,即抗原侵入抗体2抗体1.于是,人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗,必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子,也就是单克隆抗体。多克隆抗体多克隆抗体在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。单克隆抗体单克隆抗体由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。.补充 要根据糖基化的结构,选择适宜的细胞系要根据糖基化的结构,选择适宜的细胞系糖代谢特点,氨基酸代谢特点,选择适宜糖代谢特点,氨基酸代谢特点,选择适宜的细胞系。的
9、细胞系。.细胞系细胞系FucGal唾液酸唾液酸1,61,3Fuc1,3GalSO4-GalNAc2,32,6糖糖 基基化化等等分分GluNAcBHK+0+0+0-0CHO+-00+0+0鼠杂交瘤鼠杂交瘤+0+0+0+0C127+0+0J558L+0+-+0人淋巴细胞人淋巴细胞+000+0+人垂体人垂体+00+0+Namalwa+000+-人鼠杂交瘤人鼠杂交瘤+000+0.动物细胞制药的表达系统与特征动物细胞制药的表达系统与特征昆昆虫虫系系统统、哺哺乳乳动动物物细细胞胞系系统统,最最成成功功、重重要要表表达达活活性外源蛋白的有效系统,应用于药物蛋白质的表达。性外源蛋白的有效系统,应用于药物蛋白质
10、的表达。一、哺乳动物细胞表达系统与特征一、哺乳动物细胞表达系统与特征1.动物细胞的特征动物细胞的特征细胞膜、细胞膜、细胞质和细胞核,没有细胞壁。亚细胞器,功能独特。细胞质和细胞核,没有细胞壁。亚细胞器,功能独特。内容(二)内容(二).2哺乳动物细胞株系哺乳动物细胞株系CHO细细胞胞:中中国国仓仓鼠鼠卵卵巢巢中中分分离离的的上上皮皮样样细细胞胞系系,贴贴壁壁型型生生长长,是是目目前前使使用用最最为为普普遍遍和和成成熟熟的的表表达达糖糖基基化化蛋蛋白白药药物物的的宿宿主主细细胞胞。核核型型为为亚亚二二倍倍体体,分分泌泌表表达达外外源源蛋蛋白白,而而内内源源蛋蛋白白分分泌泌很很少少。贴贴壁壁型型生生
11、长长细细胞胞,但但可可进进行行悬悬浮浮培培养养,对对剪剪切切力力和和渗渗透透压压有有较较高高的的忍忍受受能能力力。蛋蛋白白质质翻翻译译后后的的修修饰准确,表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。饰准确,表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。有有多多种种衍衍生生突突变变株株应应用用于于药药物物的的生生产产,培培养养时时需需要要添添加加脯脯氨氨酸酸。二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶缺缺陷陷株株表表达达的的药药物物有有tPA、EPO、HBsAg疫苗、疫苗、G-CSF、凝血因子、凝血因子、DNA酶酶,已上市。,已上市。使使用用氨氨甲甲酰酰喋喋呤呤,增增加加外外源源基基因因的的拷拷贝贝数数,提提高高蛋蛋白
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