实验--薄层色谱法.ppt

实验实验 3 薄层色谱法薄层色谱法2024/5/12 周日1.1.1.了解色谱分离的原理及其应用。了解色谱分离的原理及其应用。2.2.初步掌握薄层色谱的操作技能。初步掌握薄层色谱的操作技能。目的和要求目的和要求2024/5/12 周日2.色谱法概述色谱法概述 1938193819381938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。一种天然药物。一种天然药物。一种天然药物。1965196519651965年德国化学家出版了年德国化学家出版了年德国化学家出版了年德国化学家出版了“薄层薄层薄层薄层色谱法色谱法色谱法色谱法”一书，推动了这一技术的发展。一书，推动了这一技术的发展。一书，推动了这一技术的发展。一书，推动了这一技术的发展。2024/5/12 周日3.色色谱谱法法（ChromatographyChromatography）亦亦称称色色层层法法、层层析析法法等等。色色谱谱法法是是分分离离、纯纯化化和和鉴鉴定定有有机机化化合合物物的的重要方法之一。重要方法之一。色色谱谱法法的的基基本本原原理理是是利利用用混混合合物物各各组组分分在在某某一一物物质质中中的的吸吸附附或或溶溶解解性性能能（分分配配）的的不不同同，或或其其亲亲和和性性的的差差异异，使使混混合合物物的的溶溶液液流流经经该该种种物物质质进进行行反反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。色谱法原理色谱法原理2024/5/12 周日4.1.1.1.1.按固定相所处的状态分类按固定相所处的状态分类按固定相所处的状态分类按固定相所处的状态分类 ：薄层色谱（薄层色谱（薄层色谱（薄层色谱（Thin Layer ChromatographyThin Layer ChromatographyThin Layer ChromatographyThin Layer Chromatography）柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱 （Column ChromatographyColumn ChromatographyColumn ChromatographyColumn Chromatography）纸色谱纸色谱纸色谱纸色谱 （Paper ChromatographyPaper ChromatographyPaper ChromatographyPaper Chromatography）2.2.2.2.按分离机理分类：按分离机理分类：按分离机理分类：按分离机理分类：吸附色谱（吸附色谱（吸附色谱（吸附色谱（Adsorption ChromatographyAdsorption ChromatographyAdsorption ChromatographyAdsorption Chromatography）分配色谱（分配色谱（分配色谱（分配色谱（Partition ChromatographyPartition ChromatographyPartition ChromatographyPartition Chromatography）离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（I ECI ECI ECI EC）凝胶色谱（凝胶色谱（凝胶色谱（凝胶色谱（GPCGPCGPCGPC）vv 分分 类类2024/5/12 周日5.6如上色谱都属吸附色谱类型，用固体吸附剂作固如上色谱都属吸附色谱类型，用固体吸附剂作固定相，以不同溶剂作流动相，依据样品中各组分定相，以不同溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离仪器分析实验 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)(HPLC)气相色谱气相色谱 (GC)(GC)2024/5/12 周日6.色谱法三要素色谱法三要素吸附剂（固定相）：吸附剂（固定相）：用于与样品发生吸附作用的固定不动的用于与样品发生吸附作用的固定不动的 物质。在混合物样品流经固定相的过程物质。在混合物样品流经固定相的过程 中，由于各组分与固定相吸附力的不同，中，由于各组分与固定相吸附力的不同，就产生了速度的差异，从而将混合物中就产生了速度的差异，从而将混合物中 的各组分分开。的各组分分开。2024/5/12 周日7.氧化铝（氧化铝（aluminaalumina）氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的活性与含水量有关，含键电子对。氧化铝的活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无水氧水量越低，活性越大，吸附力越强。无水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的活性分为五级可将氧化铝的活性分为五级 。吸附色谱三要素吸附色谱三要素吸附吸附剂剂2024/5/12 周日8.*酸性氧化铝酸性氧化铝酸性氧化铝酸性氧化铝（pHpHpHpH5-45-45-45-4），），），），适用于分离酸性化合物适用于分离酸性化合物适用于分离酸性化合物适用于分离酸性化合物 和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨 基酸类等。基酸类等。基酸类等。基酸类等。*中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝（pHpHpHpH7.57.57.57.5），），），），适用与分离生物碱、挥适用与分离生物碱、挥适用与分离生物碱、挥适用与分离生物碱、挥 发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙 类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧类、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧 化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。化铝层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。*碱性氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝（pHpHpHpH9-109-109-109-10），），），），适用于碱性，如生物适用于碱性，如生物适用于碱性，如生物适用于碱性，如生物 碱和中性化合物的分离。碱和中性化合物的分离。碱和中性化合物的分离。碱和中性化合物的分离。吸附色谱三要素吸附色谱三要素吸附吸附剂剂2024/5/12 周日9.硅胶硅胶silica gel silica gel 它的吸附性来源于硅它的吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢电子对和可以形成氢键的羟基。羟基有结键的羟基。羟基有结合型（合型（）、活性型）、活性型（）和游离型）和游离型（）三种）三种吸附色谱三要素吸附色谱三要素吸附吸附剂剂2024/5/12 周日10.活性氧化铝含水量（）硅胶含水量（）0 00 03 35 58 815151010252515153838吸附色谱三要素吸附色谱三要素吸附吸附剂剂2024/5/12 周日11.洗脱剂（流动相）：洗脱剂（流动相）：也称展开剂，在色谱过程中起到将吸附也称展开剂，在色谱过程中起到将吸附 在固定相上的样品洗脱的作用。在固定相上的样品洗脱的作用。乙乙酸酸 吡吡啶啶 水水 醇醇类类（甲甲醇醇 乙乙醇醇 正正丙丙醇醇）丙丙酮酮 乙乙酸酸乙乙酯酯 乙乙醚醚 氯氯仿仿 二二氯氯甲甲烷烷 甲甲苯苯 环环己己烷烷 正正己烷己烷 石油醚石油醚 *从前到后从前到后-洗脱能力降低。洗脱能力降低。2024/5/12 周日12.试样：试样：在给定的条件下，各个成分的分离情况，在给定的条件下，各个成分的分离情况，在给定的条件下，各个成分的分离情况，在给定的条件下，各个成分的分离情况，与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂与被分离物质的结构和性质有关，对极性吸附剂而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也而言，被分离物质的极性越大，两者吸附作用也越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下越强。具有极性基团的化合物，其吸附能力按下列顺序增加：列顺序增加：列顺序增加：列顺序增加：Cl,Br,I C=C OCHCl,Br,I C=C OCH3 3 CO CO2 2R CR C=O,=O,=O,=O,CHO -SH-NHCHO -SH-NH2 2 -OH -CO -OH -CO2 2H H 结论：若样品极性越小，或流动相极性越大，样品结论：若样品极性越小，或流动相极性越大，样品 在固定相上的移动速度则越快。在固定相上的移动速度则越快。2024/5/12 周日13.在吸附层析中，试样、洗脱剂和吸附剂三者关在吸附层析中，试样、洗脱剂和吸附剂三者关系。它们三者的关系如下图。系。它们三者的关系如下图。StahlStahl简图简图 （1 1）离化合物的极性；）离化合物的极性；（2 2）吸附剂的活度；）吸附剂的活度；（3 3）展开剂的极性。）展开剂的极性。若将这三个因素各自固定在圆周的三若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一，转动圆盘正中的三角形，如分之一，转动圆盘正中的三角形，如果角果角A A指向极性物质，则角指向极性物质，则角B B指向活度指向活度小的吸附剂，角小的吸附剂，角C C就指向选用极性展就指向选用极性展开剂；开剂；A,B,C,处则是合理的选择处则是合理的选择组合。组合。2024/5/12 周日14.有机化学中的应用有机化学中的应用*分离混合物：分离混合物：一一些些结结构构类类似似、理理化化性性质质也也相相似似的的化化合合物物组组成成的的混混合合物物，一一般般应应用用化化学学方方法法分分离离很很困困难难，但但应应用用色色谱谱法分离，有时可得到满意的结果。法分离，有时可得到满意的结果。*精制提纯化合物：精制提纯化合物：有有机机化化合合物物中中含含有有少少量量结结构构类类似似的的杂杂质质，不不易易除除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。15.*鉴定化合物：鉴定化合物：在在条条件件完完全全一一致致的的情情况况，纯纯粹粹的的化化合合物物在在薄薄层层色色谱谱呈呈现现一一定定的的移移动动距距离离，称称比比移移值值（R Rf f值值），所所以以利利用用色色谱谱法法可可以以鉴鉴定定化化合合物物的的纯纯度度或或确确定定两两种种性性质相似的化合物是否为同一物质。质相似的化合物是否为同一物质。*跟踪一些化学反应进程：跟踪一些化学反应进程：可可以以利利用用薄薄层层色色谱谱或或纸纸色色谱谱观观察察原原料料色色点点的的逐逐步消失，以证明反应完成与否。步消失，以证明反应完成与否。2024/5/12 周日16.薄层色谱薄层色谱 薄薄层层色色谱谱又又叫叫薄薄板板层层析析，是是色色谱谱法法中中的的一一种种，是是快快速速分分离离和和定定性性分分析析少少量量物物质质的的一一种种很很重重要要的的实实验验技技术术，属属固固-液液吸吸附附色色谱谱，它它兼兼备备了了柱柱色色谱谱和和纸纸色色谱谱的的优优点点，一一方方面面适适用用于于少少量量样样品品（几几到到几几微微克克，甚甚至至0.010.01微微克克）的的分分离离；另另一一方方面面在在制制作作薄薄层层板板时时，把把吸吸附附层层加加厚厚加加大大，又又可可用用来来精精制制样样品品，此此法法特特别别适适用用于于挥挥发发性性较较小小或或较较高高温温度度易易发发生生变变化化而而不不能能用用气气相相色色谱谱分分析析的的物物质质。此此外外，薄薄层层色色谱谱法法还还可用来可用来跟踪有机反应跟踪有机反应及进行及进行柱色谱之前的一种柱色谱之前的一种“预试预试”。2024/5/12 周日17.一、实验步骤一、实验步骤1.1.薄层板的制备薄层板的制备2.2.展开剂的选择展开剂的选择3.3.点样点样4.4.展开展开5.5.显色显色6.6.比移值比移值干铺法干铺法倾注法倾注法紫外光显色法紫外光显色法碘蒸气显色法碘蒸气显色法试剂显色法试剂显色法2024/5/12 周日18.1.1.制薄层板制薄层板硬硬板板制制备备：50mL50mL烧烧杯杯中中放放置置10g10g硅硅胶胶GFGF254 254，逐逐渐渐加加入入5%5%羧羧甲甲基基纤纤维维素素钠钠（CMCCMC）水水溶溶液液7mL7mL，调调成成均均匀匀的的糊糊状状。将将其其涂涂于于三三片片玻玻璃璃板板（7.52.5 7.52.5 cm)cm)上上，室室温温放放置置半半小小时时后，放入烘箱中在后，放入烘箱中在110110恒温半小时，即制得硬板。恒温半小时，即制得硬板。2024/5/12 周日19.2.2.点样点样样品准备：样品准备：1.偶氮苯的纯化偶氮苯的纯化 样品：样品：1%偶氮苯溶液；偶氮苯溶液；展开剂：展开剂：9:1 石油醚石油醚/乙酸乙酯乙酸乙酯 1:3 石油石油醚醚/乙酸乙酯乙酸乙酯2.苏丹苏丹的纯化的纯化 样品：样品：1%苏丹苏丹的溶液；的溶液；展开剂：展开剂：9:1 石油石油醚醚/乙酸乙酯乙酸乙酯 1:3石油石油醚醚/乙酸乙酯乙酸乙酯3.混合样品的分离混合样品的分离 样品：样品：1%偶氮苯和偶氮苯和1%苏丹苏丹溶液混合样品溶液混合样品 展开剂：展开剂：9:1石油醚石油醚/乙酸乙酯乙酸乙酯20.n n点样操作：点样操作：点样操作：点样操作：n n1.1.1.1.可利用铅笔画一条线；可利用铅笔画一条线；可利用铅笔画一条线；可利用铅笔画一条线；n n2.2.2.2.样品溶液要点在样品溶液要点在样品溶液要点在样品溶液要点在 0.7-0.8 mm0.7-0.8 mm0.7-0.8 mm0.7-0.8 mm处；处；处；处；n n3.3.3.3.采用多次点样时，应待前一次采用多次点样时，应待前一次采用多次点样时，应待前一次采用多次点样时，应待前一次点点点点n n 加的溶剂挥发后再进行加的溶剂挥发后再进行加的溶剂挥发后再进行加的溶剂挥发后再进行;uu4.4.4.4.点量应适中，避免斑点拖点量应适中，避免斑点拖点量应适中，避免斑点拖点量应适中，避免斑点拖尾尾尾尾;uu5.5.5.5.配制样品的溶剂具有挥发配制样品的溶剂具有挥发配制样品的溶剂具有挥发配制样品的溶剂具有挥发性和性和性和性和uu 小极性。小极性。小极性。小极性。2024/5/12 周日21.n n3.3.展展开开n n n n选洗脱剂可利用微量圆选洗脱剂可利用微量圆选洗脱剂可利用微量圆选洗脱剂可利用微量圆环技术；环技术；环技术；环技术；n n配制样品的溶剂具有挥配制样品的溶剂具有挥配制样品的溶剂具有挥配制样品的溶剂具有挥发性和小极性，以免发性和小极性，以免发性和小极性，以免发性和小极性，以免 斑点扩展斑点扩展斑点扩展斑点扩展,不利于分离不利于分离不利于分离不利于分离;n n洗脱剂的高度不超过洗脱剂的高度不超过洗脱剂的高度不超过洗脱剂的高度不超过0.5cm,0.5cm,0.5cm,0.5cm,以免样品被洗脱以免样品被洗脱以免样品被洗脱以免样品被洗脱剂扩散；剂扩散；剂扩散；剂扩散；微量圆环技术微量圆环技术 1 1 用环己烷展开用环己烷展开 2 2 用苯展开用苯展开 3 3 用氯仿展开用氯仿展开2024/5/12 周日22.展开槽普通展开槽普通展开槽双底展开槽双底展开槽2024/5/12 周日23.多次展开多次展开 一次展开未达满意分离时，可将一次展开未达满意分离时，可将薄层板干薄层板干 燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。次，直到混合物分离为止。梯度展开梯度展开 混合物性质差别较大时，一种流混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。同距离。二维展开二维展开在两个垂直的方向上进行展开。将在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成 90 90 的方的方向进行展开。向进行展开。2024/5/12 周日24.原点原点1 12 22024/5/12 周日25.薄层色谱示意图薄层色谱示意图12-132-22-32-42024/5/12 周日26.4.4.显色及数据记录显色及数据记录uu物理方法物理方法物理方法物理方法紫外光下显示荧光或荧光淬灭。紫外光下显示荧光或荧光淬灭。紫外光下显示荧光或荧光淬灭。紫外光下显示荧光或荧光淬灭。uu化学方法化学方法化学方法化学方法加化学试剂显色，要求显色稳定、持加化学试剂显色，要求显色稳定、持加化学试剂显色，要求显色稳定、持加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、久、久、久、uu 专属、灵敏、线性良好。专属、灵敏、线性良好。专属、灵敏、线性良好。专属、灵敏、线性良好。t t碘蒸气法碘蒸气法碘蒸气法碘蒸气法灵敏、简便，为通用显色法。将碘灵敏、简便，为通用显色法。将碘灵敏、简便，为通用显色法。将碘灵敏、简便，为通用显色法。将碘结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内结晶放在密封的展开缸中，碘的升华，使缸内充满紫色的碘蒸气。充满紫色的碘蒸气。充满紫色的碘蒸气。充满紫色的碘蒸气。n n *样品均有颜色，可直接观测，故本实验不需显色。样品均有颜色，可直接观测，故本实验不需显色。样品均有颜色，可直接观测，故本实验不需显色。样品均有颜色，可直接观测，故本实验不需显色。n n *每个样品均需记录每个样品均需记录每个样品均需记录每个样品均需记录R R R Rf f f f值，列表记录。值，列表记录。值，列表记录。值，列表记录。2024/5/12 周日27.1.1.板点样需很轻，否则固定相会粘到点样管下方。板点样需很轻，否则固定相会粘到点样管下方。2.2.一根点样管只能点一种样品，否则有交叉污染。一根点样管只能点一种样品，否则有交叉污染。3.3.样样品品点点直直径径应应不不超超过过 2 2 mmmm，样样品品点点决决不不能能浸浸到到展展开开剂中。剂中。4.4.展开剂离薄层板上缘约展开剂离薄层板上缘约0.5 cm0.5 cm时应停止走板，取出时应停止走板，取出 晾干。不可使展开剂走到板的尽头。板取出后要及晾干。不可使展开剂走到板的尽头。板取出后要及 时标记展开剂前沿，否则展开剂挥发后难以确定。时标记展开剂前沿，否则展开剂挥发后难以确定。二、注意事项二、注意事项2024/5/12 周日28.1.1.展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么 影响？影响？2.2.如何利用如何利用R Rf f值来鉴定化合物？值来鉴定化合物？3.3.为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？三、思考题三、思考题2024/5/12 周日29.