基于LPS炎症模型探究鲍姆纤孔菌%28Sanghuangporus baumi%29菌丝多糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用.pdf
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1、马晓颖,肖军,龚娜,等.基于 LPS 炎症模型探究鲍姆纤孔菌(Sanghuangporus baumi)菌丝多糖对巨噬细胞 RAW264.7 的免疫调节作用 J.食品工业科技,2023,44(20):407413.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120011MAXiaoying,XIAOJun,GONGNa,etal.ImmunomodulatoryEffectofPolysaccharideExtractedfromSanghuangporus baumiMyceliainLPS-InducedRAW264.7MacrophagesJ.ScienceandT
2、echnologyofFoodIndustry,2023,44(20):407413.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120011 营养与保健 基基于于 LPS 炎症模型探究鲍姆纤孔菌炎症模型探究鲍姆纤孔菌(Sanghuangporus baumi)菌丝多糖对巨噬)菌丝多糖对巨噬细细胞胞 RAW264.7 的免疫调节作用的免疫调节作用马晓颖1,肖军1,龚娜1,刘国丽1,陈珣1,杨涛1,姚澜2,李长田2,肇莹1,*(1.辽宁省农业科学院食用菌研究所,辽宁省食用菌优质栽培重点实验室,辽宁沈阳110161
3、;2.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心,吉林长春130118)摘要:鲍姆纤孔菌(Sanghuangporus baumi)是一种药用真菌,具有很高的活性,本文研究在脂多糖(LPS)诱导下鲍姆纤孔菌菌丝多糖对巨噬细胞 RAW264.7 的免疫调节作用。以鲍姆纤孔菌菌丝多糖(SJ)为研究对象,利用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞 RAW264.7 建立炎症模型,实验分为空白对照组,LPS 模型组,SJ 处理组(SJ+LPS),采用 CellCountingKit-8(CCK8)法检测 SJ 对巨噬细胞 RAW264.7 的增殖作用;利用酶联免疫(ELISA)法测定 SJ 对巨噬细胞 RAW26
4、4.7 一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-(TNF-)细胞因子分泌量的影响。此外,采用免疫印迹(Western-Blot)技术,研究 SJ 对 RAW264.7 细胞生成 IL-6、TNF-、IL-1 和 iNOS 蛋白能力的影响。结果表明,不同浓度的 SJ 处理后巨噬细胞的活力与对照组相比分别增加了 20.5%50%;ELISA 法结果表明:200g/mL 组的 SJ 极显著(P0.001)抑制在炎症模型下巨噬细胞 RAW264.7 产 NO 的能力,比 LPS 模型组巨噬细胞 NO、TNF-、IL-6 和 IL-分泌量分别降低了 21.62%、
5、29.99%、35.5%和 50.03%。SJ 呈剂量依赖的方式极显著(P0.001)抑制由 LPS 诱导的促炎介质 IL-6、TNF-、IL-1 和 iNOS 表达,可减轻 LPS 引发的炎症反应,且与 ELISA 法检测到的细胞因子的分泌量变化结果相一致。综上,鲍姆纤孔菌多糖具有良好的免疫调节活性。关键词:鲍姆纤孔菌,脂多糖,巨噬细胞,细胞因子本文网刊:中图分类号:R151.3文献标识码:A文章编号:10020306(2023)20040707DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120011ImmunomodulatoryEffectofPolysacchar
6、ideExtractedfromSanghuangporusbaumiMyceliainLPS-InducedRAW264.7MacrophagesMAXiaoying1,XIAOJun1,GONGNa1,LIUGuoli1,CHENXun1,YANGTao1,YAOLan2,LIChangtian2,ZHAOYing1,*(1.LiaoningAcademyofAgriculturalSciences,EdibleFungusInstitute,KeyLaboratoryofEdibleFungiHighQualityCultivation,Shenyang110161,China;2.En
7、gineeringResearchCenterofChineseMinistryofEducationforEdibleandMedicinalFungi,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)收稿日期:20221215基金项目:沈阳市科技特派团(21-116-3-23);食用菌栽培学科项目(2022DD072311);辽宁省应用基础研究计划项目(2022JH2/101300160);辽宁省义县食用菌科技特派团(2022JH5/10400057);辽宁省农业科学院院长基金项目(2022QN2303);辽宁省“揭榜挂帅”科技攻关项目(
8、2021JH1/10400035)。作者简介:马晓颖(1985),女,硕士,助理研究员,研究方向:食药用真菌活性成分及药理,Email:。*通信作者:肇莹(1981),女,硕士,副研究员,研究方向:食用菌育种、栽培,E-mail:。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTechnologyofFoodIndustryOct.2023Abstract:Sanghuangporus baumiisakindofmedicinalfunguswithhighactivity.Theaimofthepresentstudywastoinvestigate
9、theimmunoregulatoryeffectsofSanghuangporus baumimyceliapolysaccharides(SJ)onlipopolysaccharide(LPS)-inducedRAW264.7cells.Inthisstudy,Sanghuangporus baumimyceliapolysaccharides(SJ)weretakenasthestudysubjects,andLPS-stimulatedRAW264.7macrophageswereusedasthecellmodel.Theexperimentwasdividedintothreegr
10、oups:Controlgroup,LPS(model)andLPS+SJgroups.ACCK-8kitwasusedtodetecttheviabilityofRAW264.7cells.The effects of SJ on nitric oxide,and cytokines(IL-6,IL-1,and TNF-)production in LPS-stimulated RAW264.7macrophagesweremeasuredbyenzyme-linkedimmunoassayassay(ELISA).Furthermore,theeffectsofSJontheprotein
11、levelsofIL-6,TNF-,IL-1andinduciblenitricoxidesynthase(iNOS)wereinvestigatedbyWestern-Blotanalysis.TheresultsindicatedthatSJincreased20.5%50%cellviabilityatdifferentconcentrationscomparedtothecontrolgroup.SJat200g/mLpotentlyinhibitedthereleaseofnitricoxideandcytokineproductioninLPS-stimulatedRAW264.7
12、(P0.001),andcomparedwiththeLPSgroup,thesecretionofNO,TNF-,IL-6andIL-1decreasedby21.62%,29.99%,35.5%and50.03%,respectively.Moreover,SJalsoreducedLPS-inducedproteinexpressionlevelsofIL-6,TNF-,IL-1andiNOSinadose-dependentfashion(P0.001),andalleviatedtheinflammatorydamageinducedbyLPS.Anditwasconsistentw
13、iththechangeofcytokinesecretiondetectedbyELISAmethod.TheresultsofthepresentstudysuggestthatSanghuangporusbaumi myceliapolysaccharides(SJ)havegoodimmunomodulatory.Keywords:Sanghuangporus baumi;lipopolysaccharide;macrophages;cytokines长期的炎症被认为与癌症、关节炎和神经退行性变等各种疾病的进展有关。尽管在疾病发生的过程中可以暂时通过药物来解决,但是由炎症引起的感染、以
14、及抗炎类药物引起的并发症仍是引起死亡的主要因素之一1。所以,开发应用能够抑制炎症过度的天然、无毒副作用的替代药物以及能够增强宿主防御反应的免疫调节剂是非常迫切的。桑黄是一种珍贵的功能性真菌,数百年来在包括中国、韩国和日本在内的几个东亚国家被广泛用作食物来源。具有抗肿瘤2、抗氧化3、降糖4、抗氧化5等多种生物活性。鲍姆纤孔菌(Sanghuangporusbaumi)是桑黄的一个品种,一种著名真菌,幼时表面为褐色绒毛,老后细龟裂而变粗糙6,其水提取物不仅具有增强小鼠免疫力的免疫调节活性7,还可以缓解溃疡性结肠炎8以及通过分泌细胞因子来参与巨噬细胞的反应9。另一方面,鲍姆纤孔菌的子实体稀有,培养难度
15、大,不可能获得大量的提取物。目前,越来越多的人开始对食药用菌进行液体发酵培养。菌丝深层培养具有快速、经济、易控制、无重金属污染、易于从菌丝体中提取生物活性物质等优点10。在过去的二十年中,从天然产物中获得的多糖由于其有前景的有益健康活性而引起了研究的极大关注。近期,从桑黄属子实体、菌丝体和发酵液中提取和纯化的多糖被认为是负责各种健康促进作用的主要生物活性成分,包括免疫调节、抗肿瘤、抗炎、保肝、降血糖、降血脂、抗氧化和其他生物活性11。研究发现,从 Phellinus linteus和Phellinus ignarius 纯化的(13,6)-D-多糖可以显著降低 TNF-的生成,刺激高 IL-1
16、0 反应,并抑制 RAW264.7 细胞中IL-6 的转录,表明其具有免疫抑制活性12。连续 13d口服 500mg/kgPhellinus linteus 多糖能够显著改善了小鼠的健康状况,减轻了病理变化,下调了 IL-6、IL-1、TNF-和 iNOSmRNA 和蛋白质水平,并降低了 DSS 诱导的小鼠结肠组织中的 MPO 活性、MDA 和 NO 水平13。最新研究表明,一种来自Phellinus baumii 的杂多糖,命名为 SHPS-1,能够抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞中的 STAT-1通路和 DSS 诱导的小鼠溃疡性结肠炎,具有较强的抗炎活性14。对于鲍姆纤孔菌
17、多糖的研究大都集中在子实体多糖,对于菌丝多糖的药理和构效研究比较少。在前期研究工作中,实验室提取了菌丝化合物,发现其具有免疫调节作用15。在此基础上,本实验研究了鲍姆纤孔菌菌丝多糖(SJ)对脂多糖诱导下的RAW264.7 巨噬细胞的潜在免疫调节活性。利用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞 RAW264.7 建立炎症模型,研究了不同浓度 SJ 对脂多糖诱导下 RAW264.7细胞生成 IL-6、TNF-、IL-1 和 iNOS 的影响。以此了解鲍姆纤孔菌菌丝多糖(SJ)的抗炎活性,也为进一步临床应用免疫佐剂和免疫增强剂提供理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器鲍姆纤孔菌辽宁省农业科学院食用菌研究所;
18、RAW264.7 巨噬细胞吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心;DMEM 高糖培养基(pH7.27.4)、PBS 磷酸盐缓冲液(pH7.27.4)、胎牛血清美国 Gibco 公司;脂多糖(LPS)美国 Sigma 公司;CellCountingKit-8CCK8美国 MPBiomedicals生物医药公司;BCA 蛋白定量试剂盒美国 Thermo科技公司;一氧化氮检测试剂盒、细胞因子 ELISA试剂盒江苏酶联实业有限公司;RIPA 组织细胞快速裂解液、Tris-HCl 电泳缓冲液、SDS、过硫酸铵、TEMED、蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉、PBS 磷酸盐缓冲液、Tween-20北京索莱宝生物有限
19、公司;蛋白预染 MarkerFermentas 酶制剂公司;NC 膜发光液(ECL)美国 Millipore 公司;抗体 IL-6、TNF-、iNOS、IL-1、-actin英国 Abcam 抗体试剂公司;羊抗兔 HRP 标记二抗上海碧云天生物科技有限公司;其他所有化学品和溶剂均为分析纯国药化学408食品工业科技2023 年10月试剂有限公司。VS-1300U 超净工作台苏州智净净化设备有限公司;Cytoperm2 型二氧化碳培养箱美国 Thermo公司;HH-4 数显恒温水浴锅常州市江南实验仪器厂;J6-M1 低速离心机美国 BECMAN 公司;1680多功能酶标仪美国 Biotek 公司;
20、BX51T-PHD-J11 显微镜日本奥林巴斯公司;XW-80A 微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂;MiniProtean3Cell电泳仪BIO-RAD公司;TE77XP 电转仪美国HOEFER 公司;Tanon-5200 成像系统上海 Tanon科技有限公司。1.2实验方法1.2.1实验分组将 RAW264.7 细胞复苏后,混悬于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中,37、5%CO2培养箱培养,23d 换液和传代 1 次。取处于对数生长期的 RAW264.7 细胞(1106cells/mL)移于 6 孔板,37、5%CO2培养箱培养24h。细胞分为空白对照组(Control)、模型组(L
21、PS)、SJ25、50、100 和 200g/mL 组,各组设3 个复孔。除空白对照组外,其余组加入 0.1g/mLLPS,空白对照组添加含有 0.1%DMSO 的完全培养基,以上不同的组与巨噬细胞 RAW264.7 在 37培养 24h。吸取各组上清液,3000r/min 离心 10min,20 保存备用。1.2.2鲍姆纤孔菌菌丝多糖 SJ 对巨噬细胞细胞活力的影响CCK8 法检测16SJ 对 RAW264.7 细胞存活率的影响。取生长状态良好、密度达到 80%90%的 RAW264.7 细胞,密度为 1106cells/mL 接种于96 孔板中,37、5%CO2培养箱中培养 24h。实验分
22、为空白对照组(Control)和不同鲍姆纤孔菌菌丝多糖 SJ 浓度组(25、50、100、200g/mL),每组平行 6 孔。菌丝多糖 SJ 用 0.22m 滤膜过滤。对照组换含 10%胎牛血清 DMEM 培养基,SJ 组分别加入不同浓度的菌丝多糖,放入 37、5%CO2培养箱中继续培养 24h。然后避光加入细胞培养液体积1/10 的 CCK-8 于各孔中,继续培养 2h。用酶标仪于 450nm 处测定其吸光度。细胞存活率(%)=(OD实验组/OD对照组)1001.2.3鲍姆纤孔菌菌丝多糖 SJ 对巨噬细胞上清液中 NO 的生成量的影响按照 1.2.1 实验分组进行实验,收集细胞培养上清液,按
23、照酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒测定 NO 水平。1.2.4鲍姆纤孔菌菌丝多糖 SJ 对巨噬细胞中 TNF-、IL-6 和 IL-分泌量的影响RAW264.7 细胞(5105cells/mL)接种于 96 孔板中培养至对数期,按照实验分组处理:空白对照组加入 200L 的完全培养液,LPS 模型组加入培养液和脂多糖 LPS(0.2g/mL)各 100L,SJ 处理组分别加入培养液和浓度为 25、50、100、200g/mL 的提取物溶液各 100L,每组设 3 个重复。不同实验分组与巨噬细胞处理 24h后,4,3000r/min 离心 10min,收集上清液,20保存。按照 ELISA
24、试剂盒说明书步骤,检测细胞因子 TNF-、IL-6 和 IL-1。1.2.5鲍姆纤孔菌菌丝多糖 SJ 对巨噬细胞 iNOS、IL-6、IL-和 TNF-蛋白表达的影响按照“1.2.1”实验分组,每组处理均和巨噬细胞 RAW246.7 共培养 24h,然后收集各组细胞进行裂解,裂解后的样品4,12000r/min 离心 15min,取上清,进行蛋白质定量后,每孔上样量为 15g 蛋白,加入适量上样缓冲液,沸水浴 10min 后离心取上清上样。将配制好的 PAGE 胶放入电泳槽中,加入适量电泳缓冲液进行电泳,当染料到达胶底部时切断电源,停止电泳,进行下一步转膜。分离后转移到 PVDF 膜上。5%脱
25、脂奶粉室温封闭 1h,根据说明书稀释抗体,抗体iNOS、IL-6、TNF-、IL-和-actin 分别加入封闭液中稀释到所需浓度,和膜室温孵育 2h 或 4 孵育过夜。与 HRP 标记的相应二抗 37 孵育 1h,ECL 避光显色 5min。将其放入成像系统中进行扫描,以-actin 作为内参。1.3数据处理本研究获得的所有数据均经统计学处理,数据结果以平均值标准差表示。比较 ANOVA 单因素方差分析,统计软件采用 SPSS16.0forWindows,P0.05,数据结果有统计学意义,采用 GraphPadPrism9 软件绘图。2结果与分析2.1鲍姆纤孔菌菌丝多糖 SJ 对巨噬细胞 RA
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