基于GEO数据库筛选多发性硬化症关键基因Kcnc1、Kcnc2的分析研究.pdf
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1、中国免疫学杂志2023 年第 39 卷基于GEO数据库筛选多发性硬化症关键基因Kcnc1、Kcnc2的分析研究张贵斌 张闫斌 许涵 朱生东(甘肃省妇幼保健院,兰州 730000)中图分类号 R392.32 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2023)08-1600-05摘要 目的:筛选多发性硬化症(MS)的关键基因,探讨其发病机制并寻找潜在的治疗靶点。方法:从基因芯片数据库(GEO)搜索MS在皮层的基因表达数据,并分析与正常皮层组织的差异表达基因(DEGs);利用DAVID在线软件对挑选出的DEGs进行GO富集分析。基于STRING数据库及Cytoscape软件构建蛋白-蛋白互作(
2、PPI)网络,利用MCODE与Cytohubaa分析其关键基因簇并筛选出有交集的关键基因,最后在动物模型中加以验证。结果:共纳入两套MS基因芯片数据,选出有交集的DEGs 74个,其中上调基因2个,下调基因72个。DEGs GO富集分析发现钾离子跨膜转运等生物学过程与MS的发生发展相关。Cytoscape软件筛选出10个关键基因,从中选出Kcnc1、Kcnc2两个下调基因,并在小鼠EAE模型中得到验证。结论:利用生物信息学方法有效筛选出参与MS发生的Kcnc1、Kcnc2基因,为MS的治疗提供潜在的治疗靶点和策略。关键词 多发性硬化症;生物信息学分析;关键基因;Kcnc1;Kcnc2Ident
3、ifying core genes Kcnc1,Kcnc2 of multiple sclerosis by bioinformatics analysisZHANG Guibin,ZHANG Yanbin,XU Han,ZHU Shengdong.Gansu Maternal and Child Health Hospital,Lanzhou 730000,ChinaAbstract Objective:To screen key genes of multiple sclerosis(MS)and explore its pathogenesis and potential therape
4、utic targets.Methods:Gene expression data of MS in cortex were searched from the gene chip database(GEO),and differentially expressed genes(DEGs)in MS were identified.DEGs were analyzed by GO enrichment analysis using DAVID tool.A protein-protein interaction(PPI)network was constructed based on STRI
5、NG database and Cytoscape software,and the key gene clusters were analyzed using MCODE and Cytohubaa,and key genes with intersection were selected and verified in animal models.Results:A total of two sets of MS microarray data were included,and 74 DEGs were selected,with 2 up-regulated genes and 72
6、down-regulated genes.GO enrichment analysis of DEGs found that biological processes such as potassium ion transmembrane transport were associated with the development of MS.Cytoscape software was screened out 10 key genes,and two down-regulated genes Kcnc1 and Kcnc2 were selected and verified in mic
7、e EAE model.Conclusion:Kcnc1 and Kcnc2 genes involved in the occurrence of MS were effectively screened out by bioinformatics method,which provides a potential therapeutic targets and new strategies for treatment of MS.Key words Multiple sclerosis;Bioinformatics analysis;Key genes;Kcnc1;Kcnc2多发性硬化症(
8、multiple sclerosis,MS)是一种自身免疫介导的中枢神经系统慢性炎症性脱髓鞘疾病,其发病机制复杂1。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的,以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病。EAE模型能模拟出人类MS的诸多表型,是目前公认的MS理想动物模型。目前研究表明,钾离子通道与自身免疫性疾病密切相关。龙蕊2研究发现,钾离子通道能够作为调控MS多种抗原激活的致病性效应T细胞的关键作用靶点,阻断此通道可治疗包括MS在内的多种由
9、T细胞介导的免疫性疾病。Kv3家族由4个基因组成,Kcnc1、Kcnc2、Kcnc3和Kcnc4,其家族是神经元高频放电的主要决定因素3。研究表明,突变或药物抑制Kv3的功能会破坏快速刺突神经元的放电特性,影响神经递质释放,并诱导细胞死亡4。本研究通过收集美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表达汇编(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库的公共数据集(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取 MS 患者与正常人皮层组织相关基因芯doi:10.3
10、969/j.issn.1000-484X.2023.08.007通信作者,E-mail:。作者简介:张贵斌,男,硕士,主治医师,主要从事心脏电生理及免疫系统疾病研究,E-mail:。1600张贵斌等 基于GEO数据库筛选多发性硬化症关键基因Kcnc1、Kcnc2的分析研究 第 8 期片,分析其差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)并构建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,进一步挖掘关键节点及枢纽(hub)基因,明确灰质病变的分子机制,为MS的临床治疗提供新的或行之有效的方法。1 材料与方法 1.1材
11、料1.1.1实验动物SPF级雌性C57BL/6小鼠12只,68周龄,体质量(21.001.00)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001。于甘肃中医药大学动物中心饲养,温度24,相对湿度 55%65%,IVC 独立通风饲育盒,12 h昼夜节律,自由进食、饮水。1.1.2主要试剂MOG35-55多肽(GenScriPt生物科技有限公司合成);完全弗氏免疫佐剂(CFA)、百日咳毒素(PTX,美国Sigma公司);抗KCNC1单抗、抗KCNC2单抗(Affinity公司);GAPDH抗体(proteintech公司)。1.2方法1.2.1筛选 DEGs从
12、GEO 数据库中查找并筛选以“Homo sapiens”为研究对象且同时具有 MS灰质和正常对照组织样本的2个数据集:GSE135511与GSE131282,并在数据集中选择“MS lesion”和“Control”样本进行下一步分析(表1)。使用GEO2R工具分别筛选上述两个数据集中MS和正常组织样本间的DEGs,筛选条件为P0.05、|log FC|1。采用Networkanalyst在线工具绘制火山图。运用Draw Venn Diagram 软件对上述 2 个数据集的 DEGs 绘制 Venn图取交集。1.2.2GO 分析利用 DAVID(https:/David.ncifcrf.gov
13、/tools.jsp)7和 Metascape(https:/metascape.org)8在线分析工具对交集后的DEGs进行GO功能富集分析,分析其分子功能(molecular function,MF)、参与的生物学过程(biological process,BP)以及细胞组分(cellular component,CC)。富集结果均以P0.05作为纳入标准。1.2.3 构 建 PPI 网 络 并 筛 选 核 心 基 因 使 用STRING(https:/string-db.org/)平台9分析 DEGs 的蛋白相互作用信息,然后将信息导入 Cytoscape 软件,制作PPI网络图10。采
14、用MCODE11与Cytohubba12(MCC算法)两种插件分别评估DEGs的连通性得分,筛选出评分高且共有的基因作为核心基因,并进行进一步实验验证。1.2.4核心基因的实验验证1.2.4.1EAE小鼠造模12只小鼠按随机数字表随机分为正常组和模型组,每组6只。采用MOG35-55抗原免疫小鼠,具体方法见文献 13 所述。正常组小鼠在免疫诱导时只注射等量PBS,不进行任何药物干预。死亡或未发病的小鼠予以剔除。1.2.4.2 Western blot 检 测 KCNC1、KCNC2 表 达取造模后21 d(神经损伤高峰)小鼠皮层脑组织,裂解匀浆后提取蛋白,经 10%SDS-PAGE 电泳后 将
15、蛋白转移至PVDF膜,加入一抗(Anti-KCNC1单抗1 500 稀释;Anti-KCNC2 单抗 1 500 稀释;Anti-GAPDH单抗1 2 000稀释)及二抗(1 6 000稀释),ECL发光,显影,定影。采用NIH Image J 1.41计算灰度值,与内参(GAPDH)做比值后分析。1.3统计学方法采用SPSS19.0软件进行统计学分析;实验所测数据使用双侧Students t检验,数据用x s表示,以P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1DEGs筛选GSE135511数据集中获得194个DEGs(91 个上调,103 个下调);GSE131282 数据集获得 7 99
16、9个 DEGs(3个上调,7 996个下调),各数据集 DEGs 分布情况见图 1A。根据韦恩图统计出 表1数据集基本信息Tab.1Basic information about the datasetsReferences56GEOGSE135511GSE131282PlatformsGPL6883GPL10558Number of samples in control/n1042Number of samples in MS/n2037Note:A.Volcano map analysis of differential genes in GSE135511 and GSE131282;B
17、.Venn diagram DEGs were selected among GSE135511 and GSE131282.图1差异基因可视化结果Fig.1DEGs visualization results1601中国免疫学杂志2023 年第 39 卷两个数据集中有交集的DEGs 74个,其中上调基因2个,下调基因72个,见图1B。2.2GO 富集分析将两个数据集的差异基因取交集后所获得的 74个 DEGs导入 DAVID 进行富集分析。GO富集分析结果表明:细胞组分上主要富集于线粒体、蛋白激酶复合物、过氧物酶体等;分子功能主要富集于电压门控钾通道活性、受体结合、蛋白结合等;生物学过程主要
18、富集于赖氨酸分解过程、免疫球蛋白介导的体液免疫反应、钾离子跨膜转运等(图2、表2)。2.3构建PPI网络并筛选核心基因利用STRING得到的PPI网络共有74个节点,65条边(图3)。将互作结果导入 Cytoscape 软件。利用 Cytohubba 和MCODE插件分别对DEGs连通性进行计算,首先统计MCC得分前10的DEGs(图4),然后利用MCODE进一步分析网络中的关键节点和基因簇。结果显示:PPI网络中存在4个比较重要的基因簇(表3)。最终对 Cytohubba 与 MCODE 筛选出基因的结果综合分析,发现 MCC得分前 10的 DEGs与 MCODE筛选出的前两位重要基因簇的基
19、因完全重合。因此选择尚未被验证过的Kcnc1和Kcnc2两个基因开展后续的验证实验。2.4Western blot实验结果EAE小鼠造模后21 d,取正常组和模型组小鼠皮层组织,提取蛋白后进行表2DEGs GO富集分析结果(Top3)Tab.2GO enrichment analysis results of DEGs(Top3)CategoryGOTERM_CCGOTERM_CCGOTERM_CCGOTERM_MFGOTERM_MFGOTERM_MFGOTERM_BPGOTERM_BPGOTERM_BPTermGO:0005829GO:0030425GO:0005654GO:0008200G
20、O:0005249GO:0005102GO:0006554GO:0042088GO:0006887DescriptionCytosolDendriteNucleoplasmIon channel inhibitor activityVoltage-gated potassium channel activityReceptor bindingLysine catabolic processT-helper 1 type immune responseExocytosisCount5444762422P value3.05E-059.74E-040.001 817 8280.014 228 20
21、10.015 527 6590.016 101 4920.018 107 0620.020 086 7850.020 086 785Note:Bar graph of enriched functional terms.The left-hand y-axis depicts the number of genes,and the right-hand y-axis depicts the log10(P-value).The x-axis lists the enriched functional terms.图2DEGs GO富集分析结果Fig.2GO enrichment analysi
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