肌管蛋白MTM1抑制肝癌细胞迁移及侵袭的作用研究.pdf
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1、现代肿瘤医学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期mun,2020,11(1):5424.12 YANG WS,SRIRAMARATNAM R,STOCKWELL BR,et al.Reg-ulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4 J.Cell,2014,156(1-2):317-331.13 程峰,张庸,王祥,等.谷胱甘肽过氧化物酶GPX4 在铁死亡中的作用与机制研究进展J.现代肿瘤医学,2 0 2 1,2 9(7):1254 1258.CHENG F,ZHANG Y,WANG X,et al.Research progress o
2、n therole and mechanism of CPX4 in ferroptosis J.Modern Oncology,2021,29(7):1254-1258.14 ZHANG X,SUI S,ZHENG X,et al.Inhibition of tumor propellantglutathione peroxidase 4 induces ferroptosis in cancer cells andenhances anticancer effect of cisplatin J.J Cell Physiol,2020,235(4):3425 3437.15 KONOWAK
3、I Y,KURATA M,YAMAMOTO K,et al.Glutathioneperoxidase 4 overexpression inhibits ROS-induced cell death inMODERN ONCOLOGY,Nov.2023,VOL.31,No.2216LI S,HE Y,LI Q,et al.RSL3 drives ferroptosis through NF-kBpathway activation and GPX4 depletion in glioblastoma J.OxidMed Cell Longev,2021,2021:2915019.17ZHAN
4、G X,MA Y,LV G,et al.Glutathione peroxidase 4 as a ther-apeutic target for anti-colorectal cancer drug-tolerant persistercells J.Front Oncol,2022,12:913669.18 蓝炜强,陈光文,杨依昂,等.结肠癌中铁死亡相关蛋白CPX4的表达及其与预后的相关性J.临床与实验病理学杂志,2022,38(9):1035 1041,LAN WQ,CHEN GW,YANG YA,et al.Expression of ferroptosis-related prot
5、ein GPX4 and its correlation with prognosis in coloncancer J.Chinese Journal of Clinical and Experimental Patholo-gy,2022,38(9):1035-1041.(编校:谈静).4109.diffuse large B-cell lymphoma J.Lab Invest,2018,98(5):609-619.肌管蛋白 MTM1 抑制肝癌细胞迁移及侵袭的作用研究寇雪英,张格,周晓榕,熊兰,刘国晨,刘丹,吕卓敏31空军军医大学第二附属医院疼痛科;血液科;烧伤整形科,陕西西安7 10
6、0 38【摘要】目的:探讨肌管蛋白MTM1(my o t u b u l a r i n 1)在调控肝癌转移中的作用。方法:分别用生物信息学方法与免疫组化染色实验,对肝癌中MTM1的表达及临床意义进行分析。上调肝癌细胞中MTM1表达后,用细胞划痕与 Transwell迁移实验检测对细胞迁移运动能力的影响。上调肝癌细胞中 MTM1表达后,用 Tr-answell侵实验检测对细胞侵袭能力的影响。上调肝癌细胞中MTM1表达后,用实时荧光定量PCR与Westermblot实验检测对细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志分子表达的影响,从而分析
7、MTM1在肝癌细胞上皮间质转化中的调控作用。上调肝癌细胞中MTM1表达后,用裸鼠肺转移实验分析对肝癌细胞体内转移能力的影响。结果:生物信息分析与免疫组化实验证实,MTM1在肝癌组织中的表达显著低于正常肝组织,且MTM1在转移性肝癌组织中的表达显著低于原发性肝癌组织。利用公共数据对预后进行分析后发现,与MTM1高表达患者相比,MTM1 低表达肝癌患者预后更差。细胞划痕与Transwell迁移实验均证实,上调MTM1表达显著抑制了肝癌细胞的迁移运动能力。Transwell侵袭实验发现,上调MTM1表达显著降低了肝癌细胞的侵袭能力。上调肝癌细胞中MTM1表达后,上皮细胞标志蛋白E-cadherin与
8、ZO-1表达显著上调,而间质细胞标志蛋白N-cadherin与Vimentin表达显著下调,表明上调MTM1表达具有逆转肝癌细胞上皮间质转化的作用。上调MTM1显著抑制裸鼠体内肝癌细胞的转移能力。结论:MTM1表达下调可能通过诱导上皮间质转化促进肝癌细胞的迁移与侵袭。【关键词】MTM1;迁移;侵袭;上皮间质转化;肝癌【中图分类号】R735.7【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 2 -410 9-0 6The role of myotubularin 1 in the migration and invasion of liver cancer cellsKOU Xueyi
9、ng,ZHANG Ge,ZHOU Xiaorong,XIONG Lan,LIU Guochen,LIU Dan,LYU ZhuominDepartment of Pain Treatment;Department of Hematology;Department of Burn and Plastic Surgery,the Second Afiliated Hospital,Air-force Military Medical University,Shaanxi Xian 710038,China.Abstract Objective:To explore the expression a
10、nd biological functions of MTM1(myotubularin 1)in the【收稿日期】2023.03 02【基金项目】国家自然科学基金面上项目(编号:8 2 17 2 92 2)【作者简介】寇雪英(198 8),女,陕西商洛人,护师,主要从事肝癌发病分子机理研究。E-mail:4114152 0 1 q q.c o m【通信作者】吕卓敏(197 8 一),女,陕西西安人,副主任医师,博士,主要从事烧伤整形方面的工作。Em a i l:z h u o m i n l v h o t m a i l.c o m【文献标识码】A【修回日期】2 0 2 3-0 7-0
11、2D0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.22.003:4110:promotion of liver cancer metastasis.Methods:Bioinformatic analysis and immunohistochemistry staining assay wereapplied to determine the expression and prognostic significance of MTM1 in liver cancer.The effect of forced MTM1expression on migration of l
12、iver cancer cells was determined by wound healing and Transwell migration assays.Theeffect of forced MTM1 expression on invasion of liver cancer cells was determined by Transwell invasion assay.Theeffect of forced MTM1 expression on the expressions of epithelial-mesenchymal transition(EMT)markers wa
13、s deter-mined by real-time-PCR and Western blot analysis.The effect of forced MTM1 expression on the in vivo metastasisof liver cancer cells was determined by nude mice lung metastasis model.Results:Bioinformatic analysis and immuno-histochemistry staining assay revealed that MTM1 expression was mar
14、kedly decreased in tumor tssues of liver com-pared non-tumor tissues,especially in metastatic tumor tissues.In addition,patients with low MTM1 expression hadsignificant poorer survival than patients with high MTM1 expression.The migration ability of liver cancer cells was sig-nificantly suppressed w
15、hen MTM1 was overexpressed.The invasion ability of liver cancer cells was significantly de-creased when MTM1 was overexpressed.The progress of EMT was inhibited by MTM1 overexpression,as evidenced byincreased expressions of epithelial marker(E-cadherin and ZO-1)and decreased expressions of mesenchym
16、almarker(N-cadherin and Vimentin).Forced MTM1 expression significantly impaired the in vivo metastasis of livercancer cells.Conclusion:MTM1 downregulation promotes the progression of EMT and thus migration and invasion inliver cancer cells.Key words MTM1,migration,invasion,EMT,liver cancer内质网与线粒体是真核
17、细胞内调控蛋白质合成与转运、钙信号稳态与代谢等生物学过程的重要细胞器1-2 。越来越多的研究表明,内质网及线粒体功能紊乱与多种慢性疾病的发生密切相关,如神经退行性疾病、糖尿病与肿瘤等3-4 近年来,随着细胞亚显微结构研究的深入,内质网与线粒体间的相互作用被逐步揭示,二者间互作在调控线粒体多方面的功能中发挥重要作用3.5-6 ,包括线粒体分裂融合、生物发生与代谢等7 。二者互作异常已被证实与包括神经退行性疾病与肿瘤在内多种疾病的发生相关8-1肌管蛋白 MTM1(m y o t u b u la r in 1)是一种酪氨酸和丝氨酸双特异性磷酸酶,在肌肉分化中发挥重要作用,其基因突变已被证实与一种罕
18、见的遗传性肌疾病(X一连锁中央核肌病)发生密切相关12-131。近期有研究发现,MTM1通过调控内质网与线粒体相互作用而调控细胞的脂肪酸氧化4,,表明MTM1 在细胞代谢中发挥重要的调控作用。然而,MTM1在肿瘤中表达、临床意义及生物学作用均尚不清楚。本研究将分别用生物信息学分析与免疫组化、体外肿瘤转移相关实验,分析肝癌中MTM1的表达是否发生异常改变,并同时探讨MTM1表达异常在肝癌转移中的调控作用。1材料和方法1.1实验材料肝癌细胞SNU-739购自中科院上海细胞库,细胞常规保存于液氮罐内,复苏后用含10%血清的DMEM培养液培养,细胞培养箱内环境温度为37,CO,浓度为5%。细胞总RNA
19、提取与反转录试剂盒均购自takara生物公司,实时荧光定量PCR反应酶购自Thermal生物公司。Tran-swell 小室购自Corning生物公司,所有一抗和二抗均购自武汉三鹰生物公司,免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。1.2实验方法1.2.1生物信息分析肝癌中 MTM1 的表达与临床意义MTM1表达分析采用在线UALCAN分析工具(http:/ualcan.path.uab.edu/index.html)15,MTM1 表达与患者预后相关性分析采用在线KMplotter分析工具(http:/ 对非配对肝癌原发灶与转移灶组织样本,所有临床标本均来自2 0 12 年至2 0 19 年间在我
20、院普通外科进行肝癌根治性手术切除的患者,患者均在术前签署了知情同意书并在术后被病理科确诊为肝细胞肝癌。将收集到的组织标本保存于液氮中,取出后用福尔马林固定2 4h,随后用石蜡包埋并切片。将切片在实验前需置于65温箱内加热30 min使组织与玻片贴合牢固,随后将切片依次浸没于三个二甲苯、无水乙醇、8 5%乙醇、7 0%乙醇与PBS溶液中,用3%浓度的H,0,浸泡去除组织中内源性过氧化物酶后用柠檬酸溶液加热修复损伤抗原,BSA封闭非特异性抗原后滴加MTM1抗体并在4冰箱内反应10 h,加入PBS并在摇床上清洗3次,依次加人组化试剂盒中的二抗、三抗。最后,加人DAB与苏木精染色,切片经脱水与透明后封
21、片,通风橱中晾干后在显微镜下对组织细胞中MTM1染色强度进行观察。1.2.3转染MTM1真核表达载体上调肝癌细胞中MTM1表达将对数生长的肝癌SNU-739细胞用胰蛋白酶消化、加人PBS重悬后接种至6 孔板内,待细胞贴壁后即可进行真核表达载体转染,操作步骤为:首先,分别用无血清DMEM培养液稀释lipofectamine3000与MTM1真核表达载体,随后将二者混合并加人细胞培养板中,于培养箱中培养2 4h即可进行后续实验。1.2.4实时荧光定量PCR实验首先,按RNA提取试剂盒说明书中步骤,提取不同MTM1表达组细胞中的总RNA,随后用反转录试剂盒将所提RNA反转录合成cDNA。最后,以cD
22、NA为模板通过实时荧光定量PCR检测目的基因的表达。PCR扩增引物序列分别为:MTM1:F-5-GTTTGAGATCCTCACGAGATA-3;R-5-GTCCATCCATCCACGTTAAAC-3E-cadherin:F-5-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3;R-5-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3 N-cadherin:F-5-AGCTCCATTCCGACTTAGACA-3;R-5-CAGCCTGAGCACGAAGAGTG-3。ZO -肌管蛋白MTM1抑制肝癌细胞迁移及侵袭的作用研究Modern Oncology 2023,31(22):4109-4114现代肿瘤医
23、学2 0 2 3年11月第31卷第2 2 期1:F-5-CGACCAGATCCTCAGGGTAA-3;R-5-TCCATAGGGAGATTCCTTCTCA-3。V im e n t in:F-5-G A C G C C A T C AACACCGAGTT-3;R-5-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3。内参-actin:F-5-TCGCCTTTGCCGATCCG-3;R-5-ATGATCTGGGTCATCTTCTCG-3最后,用2-AC公式计算目的基因在不同组细胞中的相对表达水平。1.2.5Western blot 实验弃去肝癌细胞培养上清,加入RIPA裂解液在冰上裂解40min,
24、用移液器反复吹打并将裂解液转移至1.5mL的离心管内,用离心机在4条件下离心2 0 min,小心收集上清中的蛋白后加人含SDS的上样缓冲液,混匀后置于沸水中煮5min,冷却后上样并在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离,将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭1h后加入一抗、二抗孵育,最后加入发光液对各组细胞内目的蛋白的相对表达(特异性条带灰度强度)进行分析。1.2.6划痕实验将不同MTM1表达组肝癌细胞用胰蛋白酶消化并加入PBS溶液重悬,将310 个细胞接种至6 孔板内,次日待细胞贴壁并生长至培养板底面8 0%90%时,用枪头进行划线,随后在显微镜下对各组细胞的划痕进行拍照,将6 孔板细胞置
25、于培养箱中继续培养48 h后取出,显微镜下再次对划痕进行拍照。最后,比较不同MTM1表达组肝癌细胞划痕愈合的百分比。1.2.7Transwell 小室检测细胞迁移与侵袭将不同MTM1表达组肝癌细胞用胰蛋白酶消化,并加入PBS溶液重悬,分别用不含基质胶与含基质胶的 Transwell 小室检测细胞的迁移与侵袭能力。将0.2 mL合计310*个A3721-1-2-3-Normal(n=165)A:MTM1 在正常肝组织与肝癌组织中的表达分析(*P0.05);B:MTM1表达与肝癌患者总体生存的关系;C:MTM1表达与肝癌患者无疾病进展生存的关系。Fig.1 Bioinformatics analy
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- 蛋白 MTM1 抑制 肝癌 细胞 迁移 侵袭 作用 研究
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